فعالیت بیولوژیکی پودر دانه کلم و ترکیبات آن به عنوان لاروکش سازگار با محیط زیست در برابر پشه ها

به طور موثرکنترل پشه هاو کاهش بروز بیماری هایی که حامل آنها هستند، جایگزین های استراتژیک، پایدار و سازگار با محیط زیست برای آفت کش های شیمیایی مورد نیاز است.ما کنجاله‌های دانه‌ای از برخی از Brassicaceae (خانواده Brassica) را به‌عنوان منبع ایزوتیوسیانات‌های مشتق شده از گیاه که توسط هیدرولیز آنزیمی گلوکوزینولات‌های غیرفعال بیولوژیکی برای استفاده در کنترل Aedes مصری تولید می‌شوند، ارزیابی کردیم (L., 1762).کنجاله دانه بدون چربی (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 و Thlaspi arvense - سه نوع اصلی غیرفعال سازی حرارتی و فعالسازی حرارتی محصولات برای تعیین سمیت (LC50) آلیل ایزوتیوسیانات، بنزیل ایزوتیوسیانات و 4-هیدروکسی بنزیلیزوتیوسیانات برای لاروهای Aedes aegypti در مواجهه 24 ساعته = 0.04 گرم در 120 میلی لیتر dH2O).مقادیر LC50 برای خردل، خردل سفید و دم اسب.کنجاله دانه به ترتیب 0.05، 0.08 و 0.05 در مقایسه با آلیل ایزوتیوسیانات (LC50 = 19.35 ppm) و 4 بود.این نتایج با تولید کنجاله دانه یونجه مطابقت دارد.راندمان بالاتر استرهای بنزیل مربوط به مقادیر LC50 محاسبه شده است.استفاده از پودر دانه می تواند یک روش موثر برای کنترل پشه باشد.اثربخشی پودر دانه چلیپایی و اجزای شیمیایی اصلی آن در برابر لارو پشه و نشان می دهد که چگونه ترکیبات طبیعی در پودر دانه چلیپایی می تواند به عنوان یک لاروکش سازگار با محیط زیست امیدوار کننده برای کنترل پشه عمل کند.
بیماری های منتقله از طریق ناقل ناشی از پشه های Aedes یک مشکل عمده بهداشت عمومی جهانی است.شیوع بیماری های منتقله از طریق پشه به صورت جغرافیایی 1،2،3 گسترش می یابد و دوباره ظهور می کند و منجر به شیوع بیماری های شدید می شود 4،5،6،7.گسترش بیماری ها در بین انسان ها و حیوانات (به عنوان مثال، چیکونگونیا، تب دانگ، تب دره ریفت، تب زرد و ویروس زیکا) بی سابقه است.تب دنگی به تنهایی تقریباً 3.6 میلیارد نفر را در مناطق گرمسیری در معرض خطر عفونت قرار می دهد که تخمین زده می شود سالانه 390 میلیون عفونت رخ می دهد که منجر به مرگ 6100 تا 24300 نفر در سال می شود.ظهور و شیوع مجدد ویروس زیکا در آمریکای جنوبی به دلیل آسیب مغزی که در کودکان متولد شده از زنان آلوده ایجاد می کند، توجه جهانی را به خود جلب کرده است.کرمر و همکاران 3 پیش‌بینی می‌کنند که دامنه جغرافیایی پشه‌های آئدس به گسترش خود ادامه خواهد داد و تا سال 2050، نیمی از جمعیت جهان در معرض خطر ابتلا به آربوویروس‌های منتقله از پشه قرار خواهند گرفت.
به استثنای واکسن‌های اخیراً تولید شده علیه تب دنگی و تب زرد، واکسن‌هایی علیه اکثر بیماری‌های منتقله از طریق پشه هنوز ساخته نشده‌اند.واکسن ها هنوز در مقادیر محدود در دسترس هستند و فقط در آزمایشات بالینی استفاده می شوند.کنترل ناقلان پشه با استفاده از حشره کش های مصنوعی یک استراتژی کلیدی برای کنترل شیوع بیماری های منتقله از پشه بوده است 12،13.اگرچه آفت‌کش‌های مصنوعی در کشتن پشه‌ها مؤثر هستند، استفاده مداوم از آفت‌کش‌های مصنوعی بر ارگانیسم‌های غیرهدف تأثیر منفی می‌گذارد و محیط‌زیست را آلوده می‌کند14،15،16.حتی نگران کننده تر، روند افزایش مقاومت پشه ها به حشره کش های شیمیایی 17،18،19 است.این مشکلات مرتبط با آفت کش ها، جستجو برای جایگزین های موثر و سازگار با محیط زیست برای کنترل ناقلان بیماری را تسریع کرده است.
گیاهان مختلفی به عنوان منابع آفت کش ها برای کنترل آفات توسعه یافته اند20،21.مواد گیاهی عموماً دوستدار محیط زیست هستند زیرا زیست تخریب پذیر هستند و سمیت کم یا ناچیز برای موجودات غیرهدف مانند پستانداران، ماهی ها و دوزیستان دارند20،22.آماده‌سازی‌های گیاهی برای تولید انواع ترکیبات زیست فعال با مکانیسم‌های اثر متفاوت برای کنترل مؤثر مراحل مختلف زندگی پشه‌ها شناخته شده‌اند.ترکیبات مشتق شده از گیاه مانند اسانس ها و سایر مواد فعال گیاهی مورد توجه قرار گرفته اند و راه را برای ابزارهای نوآورانه برای کنترل ناقلان پشه هموار کرده اند.اسانس ها، مونوترپن ها و سسکوئی ترپن ها به عنوان دافع، بازدارنده تغذیه و تخم کش ها عمل می کنند27،28،29،30،31،32،33.بسیاری از روغن‌های گیاهی باعث مرگ لارو پشه، شفیره و بالغین می‌شوند.
مطالعات اخیر بینشی در مورد استفاده بالقوه از گیاهان خردل و دانه های آن به عنوان منبع ترکیبات فعال زیستی ارائه کرده است.کنجاله دانه خردل به‌عنوان ماده‌ای بیوفومگانت آزمایش شده است.نماتدهای 41،51، 52، 53، 54 و آفات 55، 56، 57، 58، 59، 60. فعالیت قارچ کشی این پودرهای بذر به ترکیبات محافظ گیاهی به نام ایزوتیوسیانات ها نسبت داده می شود38،42،60.در گیاهان، این ترکیبات محافظ در سلول های گیاهی به شکل گلوکوزینولات های غیر فعال زیستی ذخیره می شوند.با این حال، هنگامی که گیاهان در اثر تغذیه حشرات یا عفونت پاتوژن آسیب می بینند، گلوکوزینولات ها توسط میروزیناز به ایزوتیوسیانات های زیست فعال هیدرولیز می شوند55،61.ایزوتیوسیانات‌ها ترکیبات فراری هستند که دارای فعالیت ضد میکروبی و حشره‌کشی با طیف وسیع هستند و ساختار، فعالیت بیولوژیکی و محتوای آن‌ها به طور گسترده‌ای در میان گونه‌های Brassicaceae متفاوت است.
اگرچه ایزوتیوسیانات های مشتق شده از کنجاله دانه خردل دارای فعالیت حشره کش هستند، اطلاعاتی در مورد فعالیت بیولوژیکی علیه ناقلان بندپایان مهم پزشکی وجود ندارد.مطالعه ما فعالیت لاروکشی چهار پودر دانه بدون چربی را در برابر پشه های Aedes مورد بررسی قرار داد.لارو Aedes aegypti.هدف از این مطالعه ارزیابی استفاده بالقوه آنها به عنوان آفت کش های زیستی سازگار با محیط زیست برای کنترل پشه بود.سه جزء شیمیایی اصلی پودر دانه، آلیل ایزوتیوسیانات (AITC)، بنزیل ایزوتیوسیانات (BITC) و 4-هیدروکسی بنزیلیزوتیوسیانات (4-HBITC) نیز برای آزمایش فعالیت بیولوژیکی این اجزای شیمیایی بر روی لارو پشه آزمایش شدند.این اولین گزارشی است که اثربخشی چهار پودر دانه کلم و ترکیبات شیمیایی اصلی آنها را در برابر لارو پشه ارزیابی می کند.
کلنی های آزمایشگاهی Aedes aegypti (سویه راکفلر) در دمای 26 درجه سانتی گراد، رطوبت نسبی 70 درصد (RH) و 10:14 ساعت (دوره نوری L:D) نگهداری شدند.ماده های جفت شده در قفس های پلاستیکی (ارتفاع 11 سانتی متر و قطر 9.5 سانتی متر) قرار گرفتند و از طریق سیستم تغذیه بطری با استفاده از خون سیترات شده گاو (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA) تغذیه شدند.تغذیه خون طبق معمول با استفاده از یک تغذیه کننده چند شیشه ای غشایی (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA) متصل به یک لوله حمام آب در گردش (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) با دما انجام شد. کنترل 37 درجه سانتی گرادیک فیلم از پارافیلم M را روی ته هر محفظه تغذیه شیشه ای (مساحت 154 میلی متر مربع) بکشید.سپس هر فیدر روی شبکه بالایی که قفس حاوی ماده جفت گیری را می پوشاند قرار داده شد.تقریباً 350-400 میکرولیتر خون گاو با استفاده از پیپت پاستور (Fishebrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) به یک قیف تغذیه کننده شیشه ای اضافه شد و کرم های بالغ حداقل به مدت یک ساعت تخلیه شدند.سپس به زنان باردار محلول ساکارز 10% داده شد و به آنها اجازه داده شد تا تخم‌ها را روی کاغذ صافی مرطوب که در فنجان‌های سوفله کاملاً شفاف (اندازه 1.25 fl oz، Dart Container Corp., Mason, MI, USA) قرار داده شده بود بگذارند.قفس با آبکاغذ صافی حاوی تخم مرغ را در یک کیسه در بسته (SC Johnsons, Racine, WI) قرار داده و در دمای 26 درجه سانتی گراد نگهداری کنید.تخم ها از تخم خارج شدند و تقریباً 200 تا 250 لارو در سینی های پلاستیکی حاوی مخلوطی از غذای خرگوش (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) و پودر کبد (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, ایالات متحده آمریکا).و فیله ماهی (TetraMin، Tetra GMPH، Meer، آلمان) به نسبت 2:1:1.لاروهای سن سوم اواخر در سنجش های زیستی ما مورد استفاده قرار گرفتند.
مواد بذر گیاهی مورد استفاده در این مطالعه از منابع تجاری و دولتی زیر بدست آمد: Brassica juncea (خردل قهوه ای-طلای اقیانوس آرام) و Brassica juncea (خردل سفید-Ida Gold) از تعاونی کشاورزان شمال غرب اقیانوس آرام، ایالت واشنگتن، ایالات متحده.(Garden Cress) از Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, USA و Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) از USDA-ARS, Peoria, IL, USA.هیچ یک از بذرهای مورد استفاده در این مطالعه با آفت کش تیمار نشدند.کلیه مواد بذر در این مطالعه مطابق با مقررات محلی و ملی و با رعایت کلیه مقررات محلی و ملی مربوطه فرآوری و مورد استفاده قرار گرفت.این مطالعه ارقام گیاهان تراریخته را بررسی نکرد.
دانه های Brassica juncea (PG)، یونجه (Ls)، خردل سفید (IG)، Thlaspi arvense (DFP) با استفاده از آسیاب اولتراسانتریفیوژ Retsch ZM200 (Retsch، هان، آلمان) مجهز به مش 0.75 میلی متری و ضد زنگ به پودر تبدیل شدند. روتور فولادی 12 دندانه 10000 دور در دقیقه (جدول 1).پودر دانه آسیاب شده به یک انگشتانه کاغذی منتقل شد و با هگزان در دستگاه سوکسله به مدت 24 ساعت چربی زدایی شد.یک نمونه فرعی از خردل صحرایی بدون چربی در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت برای دناتوره کردن میروزیناز و جلوگیری از هیدرولیز گلوکوزینولاتها برای تشکیل ایزوتیوسیاناتهای فعال بیولوژیکی تحت حرارت قرار گرفت.پودر دانه دم اسب تیمار شده با حرارت (DFP-HT) به عنوان کنترل منفی با دناتوره کردن میروزیناز استفاده شد.
محتوای گلوکوزینولات کنجاله دانه بدون چربی با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) طبق یک پروتکل قبلاً منتشر شده 64 در سه تکرار تعیین شد.به طور خلاصه، 3 میلی لیتر متانول به نمونه 250 میلی گرمی پودر دانه بدون چربی اضافه شد.هر نمونه به مدت 30 دقیقه در حمام آب فراصوت قرار گرفت و به مدت 16 ساعت در تاریکی در دمای 23 درجه سانتیگراد قرار گرفت.مقدار 1 میلی لیتر از لایه آلی سپس از طریق یک فیلتر 0.45 میکرومتر به یک نمونه برداری خودکار فیلتر شد.با اجرا بر روی یک سیستم HPLC Shimadzu (دو پمپ LC 20AD؛ نمونه‌بردار خودکار SIL 20A؛ گاززدایی DGU 20As؛ آشکارساز UV-VIS SPD-20A برای نظارت در 237 نانومتر؛ و ماژول گذرگاه ارتباطی CBM-20A)، میزان گلوکوزینولات موجود در من را تعیین کرد. در سه نسخه .با استفاده از نرم افزار Shimadzu LC Solution نسخه 1.25 (شرکت Shimadzu، کلمبیا، MD، ایالات متحده آمریکا).این ستون یک ستون فاز معکوس C18 Inertsil بود (250 میلی‌متر × 4.6 میلی‌متر؛ RP C-18، ODS-3، 5u؛ GL Sciences، Torrance، CA، ایالات متحده).شرایط فاز متحرک اولیه در 12٪ متانول / 88٪ 0.01 مولار هیدروکسید تترابوتیل آمونیوم در آب (TBAH؛ سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) با سرعت جریان 1 میلی لیتر در دقیقه تنظیم شد.پس از تزریق 15 میکرولیتر نمونه، شرایط اولیه به مدت 20 دقیقه حفظ شد و سپس نسبت حلال بر روی متانول 100 درصد تنظیم شد و زمان کل آنالیز نمونه 65 دقیقه بود.یک منحنی استاندارد (مبتنی بر nM/mAb) با رقت‌های سریالی استانداردهای سیناپین، گلوکوزینولات و میروزین تازه تهیه شده (Sigma-Aldrich، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) برای تخمین میزان گوگرد در کنجاله دانه‌های بدون چربی ایجاد شد.گلوکوزینولات هاغلظت گلوکوزینولات در نمونه ها بر روی دستگاه HPLC Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) با استفاده از نسخه OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) مجهز به همان ستون و با استفاده از روشی که قبلاً توضیح داده شده بود، آزمایش شد.غلظت گلوکوزینولات تعیین شد.بین سیستم های HPLC قابل مقایسه باشد.
آلیل ایزوتیوسیانات (94٪، پایدار) و بنزیل ایزوتیوسیانات (98٪) از Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) خریداری شد.4-Hydroxybenzylisothiocyanate از ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) خریداری شد.هنگامی که به صورت آنزیمی توسط میروزیناز هیدرولیز می شوند، گلوکوزینولات ها، گلوکوزینولات ها و گلوکوزینولات ها به ترتیب آلیل ایزوتیوسیانات، بنزیل ایزوتیوسیانات و 4-هیدروکسی بنزیلیزوتیوسیانات را تشکیل می دهند.
زیست سنجی آزمایشگاهی بر اساس روش Muturi و همکاران انجام شد.32 با تغییرات.پنج خوراک دانه کم چرب در این مطالعه استفاده شد: DFP، DFP-HT، IG، PG و Ls.20 لارو در یک بشر 400 میلی لیتری یکبار مصرف سه طرفه (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) حاوی 120 میلی لیتر آب دیونیزه (dH2O) قرار داده شدند.هفت غلظت کنجاله دانه برای سمیت لارو پشه مورد آزمایش قرار گرفت: 0.01، 0.02، 0.04، 0.06، 0.08، 0.1 و 0.12 گرم کنجاله دانه / 120 میلی لیتر dH2O برای کنجاله دانه DFP، DFP-HPGT، IG و.ارزیابی‌های زیستی اولیه نشان می‌دهد که آرد بذر Ls بدون چربی سمی‌تر از چهار آرد دیگر آزمایش‌شده است.بنابراین، ما هفت غلظت تیمار کنجاله دانه Ls را به غلظت‌های زیر تنظیم کردیم: 0.015، 0.025، 0.035، 0.045، 0.055، 0.065 و 0.075 گرم در 120 میلی‌لیتر dH2O.
یک گروه کنترل درمان نشده (dH20، بدون مکمل کنجاله دانه) برای ارزیابی مرگ و میر طبیعی حشرات تحت شرایط سنجش وارد شد.سنجش های زیستی سم شناسی برای هر کنجاله دانه شامل سه فنجان سه شیب تکراری (20 لارو اواخر سن سوم در هر فنجان)، برای مجموع 108 ویال بود.ظروف تیمار شده در دمای اتاق (21-20 درجه سانتیگراد) نگهداری شدند و مرگ و میر لاروها طی 24 و 72 ساعت مواجهه مداوم با غلظت های تیمار ثبت شد.اگر بدن و زائده‌های پشه هنگام سوراخ کردن یا لمس یک کفگیر نازک فولادی ضد زنگ حرکت نکنند، لارو پشه مرده در نظر گرفته می‌شود.لاروهای مرده معمولاً در حالت پشتی یا شکمی در انتهای ظرف یا روی سطح آب بی حرکت می مانند.آزمایش سه بار در روزهای مختلف با استفاده از گروه‌های مختلف لارو، برای مجموع 180 لارو در معرض هر غلظت تیمار تکرار شد.
سمیت AITC، BITC، و 4-HBITC برای لارو پشه با استفاده از روش سنجش زیستی مشابه اما با تیمارهای مختلف ارزیابی شد.برای هر ماده شیمیایی محلول های استوک 100000 ppm را با افزودن 100 میکرولیتر از ماده شیمیایی به 900 میکرولیتر اتانول مطلق در یک لوله سانتریفیوژ 2 میلی لیتری و تکان دادن به مدت 30 ثانیه برای مخلوط کردن کامل آماده کنید.غلظت‌های تیمار بر اساس سنجش‌های زیستی اولیه ما تعیین شد، که نشان داد BITC بسیار سمی‌تر از AITC و 4-HBITC است.برای تعیین سمیت، 5 غلظت BITC (1، 3، 6، 9 و 12 پی پی ام)، 7 غلظت AITC (5، 10، 15، 20، 25، 30 و 35 پی پی ام) و 6 غلظت 4-HBITC (15). ، 15، 20، 25، 30 و 35 پی پی ام).30، 45، 60، 75 و 90 پی پی ام).تیمار شاهد با 108 میکرولیتر اتانول مطلق تزریق شد که معادل حداکثر حجم تیمار شیمیایی است.آزمایش‌های زیستی مانند بالا تکرار شد و در مجموع 180 لارو در هر غلظت تیمار در معرض دید قرار گرفت.مرگ و میر لارو برای هر غلظت AITC، BITC، و 4-HBITC پس از 24 ساعت قرار گرفتن در معرض مداوم ثبت شد.
تجزیه و تحلیل پروبیت 65 داده مرگ و میر مرتبط با دوز با استفاده از نرم افزار Polo (Polo Plus، نرم افزار LeOra، نسخه 1.0) برای محاسبه 50٪ غلظت کشنده (LC50)، 90٪ غلظت کشنده (LC90)، شیب، ضریب دوز کشنده و 95 انجام شد. % غلظت کشندهبر اساس فواصل اطمینان برای نسبت های دوز کشنده برای غلظت log-تغییر شده و منحنی دوز مرگ و میر.داده های مرگ و میر بر اساس داده های تکرار ترکیبی از 180 لارو در معرض هر غلظت تیمار است.تجزیه و تحلیل احتمالی به طور جداگانه برای هر کنجاله دانه و هر جزء شیمیایی انجام شد.بر اساس فاصله اطمینان 95 درصد نسبت دوز کشنده، سمیت پودر دانه و ترکیبات شیمیایی برای لارو پشه تفاوت معنی‌داری در نظر گرفته شد، بنابراین فاصله اطمینان حاوی مقدار 1 تفاوت معنی‌داری نداشت، 0566/0 = P.
نتایج HPLC برای تعیین گلوکوزینولات های اصلی در آرد دانه های بدون چربی DFP، IG، PG و Ls در جدول 1 فهرست شده است.محتوای میروزینین در PG بالاتر از DFP بود، به ترتیب 1.5 ± 33.3 و 0.9 ± 26.5 mg / g.پودر دانه Ls حاوی 2/1 ± 6/36 میلی‌گرم در گرم گلوکوگلیکون بود، در حالی که پودر دانه IG حاوی 5/0 ± 0/38 میلی‌گرم بر گرم سیناپین بود.
لارو Ae.پشه‌های Aedes aegypti هنگام درمان با پودر دانه‌های بدون چربی کشته شدند، اگرچه اثربخشی درمان بسته به گونه‌های گیاهی متفاوت بود.فقط DFP-NT پس از 24 و 72 ساعت قرار گرفتن در معرض برای لارو پشه سمی نبود (جدول 2).سمیت پودر دانه فعال با افزایش غلظت افزایش می یابد (شکل 1A, B).سمیت پودر دانه برای لارو پشه بر اساس 95% CI نسبت دوز کشنده مقادیر LC50 در ارزیابی های 24 ساعته و 72 ساعته به طور قابل توجهی متفاوت بود (جدول 3).پس از 24 ساعت، اثر سمی کنجاله دانه Ls بیشتر از سایر تیمارهای کنجاله دانه بود و بیشترین فعالیت و حداکثر سمیت برای لارو (LC50 = 0.04 g/120 ml dH2O) را داشت.لاروها در 24 ساعت نسبت به تیمارهای پودر دانه IG، Ls و PG حساسیت کمتری به DFP داشتند، با مقادیر LC50 به ترتیب 0.115، 0.04 و 0.08 g/120 ml dH2O که از نظر آماری بالاتر از مقدار LC50 بود.0.211 گرم / 120 میلی لیتر dH2O (جدول 3).مقادیر LC90 DFP، IG، PG و Ls به ترتیب 0.376، 0.275، 0.137 و 0.074 g/120 ml dH2O بود (جدول 2).بالاترین غلظت DPP 0.12 گرم در 120 میلی لیتر dH2O بود.پس از 24 ساعت ارزیابی، میانگین تلفات لارو تنها 12 درصد بود، در حالی که میانگین تلفات لاروهای IG و PG به ترتیب به 51 درصد و 82 درصد رسید.پس از 24 ساعت ارزیابی، میانگین مرگ و میر لارو برای بالاترین غلظت تیمار کنجاله دانه Ls (0.075 گرم در 120 میلی لیتر dH2O) 99٪ بود (شکل 1A).
منحنی های مرگ و میر از پاسخ دوز (Probit) Ae برآورد شد.غلظت لارو مصری (لارو سن سوم) تا آرد بذر 24 ساعت (A) و 72 ساعت (B) پس از تیمار.خط نقطه چین نشان دهنده LC50 تیمار کنجاله بذر است.DFP Thlaspi arvense، DFP-HT Heat Thlaspi arvense، IG Sinapsis alba (Ida Gold)، PG Brassica juncea (طلای اقیانوس آرام)، Ls Lepidium sativum.
در ارزیابی 72 ساعته، مقادیر LC50 کنجاله دانه DFP، IG و PG به ترتیب 0.111، 0.085 و 0.051 گرم در 120 میلی لیتر dH2O بود.تقریباً تمام لاروهایی که در معرض پودر دانه Ls قرار گرفتند پس از 72 ساعت قرار گرفتن در معرض مرگ مردند، بنابراین داده های مرگ و میر با تجزیه و تحلیل پروبیت ناسازگار بود.در مقایسه با دیگر کنجاله بذر، لاروها نسبت به تیمار کنجاله دانه DFP حساسیت کمتری داشتند و از نظر آماری مقادیر LC50 بالاتری داشتند (جدول 2 و 3).پس از 72 ساعت، مقادیر LC50 برای تیمارهای DFP، IG و PG به ترتیب 0.111، 0.085 و 0.05 گرم در 120 میلی لیتر dH2O برآورد شد.پس از 72 ساعت ارزیابی، مقادیر LC90 پودر دانه DFP، IG و PG به ترتیب 0.215، 0.254 و 0.138 گرم در 120 میلی لیتر dH2O بود.پس از 72 ساعت ارزیابی، میانگین تلفات لارو برای تیمارهای DFP، IG و PG با کنجاله دانه در حداکثر غلظت 0.12 گرم در 120 میلی لیتر dH2O به ترتیب 58، 66 و 96 درصد بود (شکل 1B).پس از ارزیابی 72 ساعته، کنجاله دانه PG سمی تر از کنجاله دانه IG و DFP بود.
ایزوتیوسیانات های مصنوعی، آلیل ایزوتیوسیانات (AITC)، بنزیل ایزوتیوسیانات (BITC) و 4-هیدروکسی بنزیلیزوتیوسیانات (4-HBITC) می توانند به طور موثر لارو پشه را از بین ببرند.در 24 ساعت پس از درمان، BITC با مقدار LC50 5.29 ppm در مقایسه با 19.35 ppm برای AITC و 55.41 ppm برای 4-HBITC (جدول 4) برای لارو سمی تر بود (جدول 4).در مقایسه با AITC و BITC، 4-HBITC سمیت کمتر و مقدار LC50 بالاتری دارد.تفاوت قابل توجهی در سمیت لارو پشه دو ایزوتیوسیانات اصلی (Ls و PG) در قوی ترین کنجاله دانه وجود دارد.سمیت بر اساس نسبت دوز کشنده مقادیر LC50 بین AITC، BITC، و 4-HBITC تفاوت آماری را نشان داد به طوری که 95% فاصله اطمینان (CI) نسبت دوز کشنده LC50 مقدار 1 را شامل نمی شود (05/0 = P، جدول 4).بالاترین غلظت BITC و AITC برای کشتن 100 درصد لاروهای آزمایش شده تخمین زده شد (شکل 2).
منحنی های مرگ و میر از پاسخ دوز (Probit) Ae برآورد شد.24 ساعت پس از درمان، لارو مصری (لارو سن 3) به غلظت ایزوتیوسیانات مصنوعی رسید.خط نقطه چین نشان دهنده LC50 برای درمان ایزوتیوسیانات است.بنزیل ایزوتیوسیانات BITC، آلیل ایزوتیوسیانات AITC و 4-HBITC.
استفاده از آفت کش های گیاهی به عنوان عوامل کنترل ناقل پشه مدت هاست مورد مطالعه قرار گرفته است.بسیاری از گیاهان مواد شیمیایی طبیعی تولید می کنند که دارای فعالیت حشره کش هستند.ترکیبات زیست فعال آنها جایگزین جذابی برای حشره کش های مصنوعی با پتانسیل زیادی در کنترل آفات از جمله پشه ها ارائه می دهد.
گیاهان خردل به عنوان یک محصول برای دانه های خود رشد می کنند، به عنوان ادویه و منبع روغن استفاده می شود.هنگامی که روغن خردل از دانه ها استخراج می شود یا هنگامی که خردل برای استفاده به عنوان سوخت زیستی استخراج می شود، محصول جانبی کنجاله دانه بدون چربی است.این پودر دانه بسیاری از اجزای طبیعی بیوشیمیایی و آنزیم های هیدرولیتیک خود را حفظ می کند.سمیت این کنجاله دانه به تولید ایزوتیوسیانات 55،60،61 نسبت داده می شود.ایزوتیوسیانات ها از هیدرولیز گلوکوزینولات ها توسط آنزیم میروزیناز در طول هیدراتاسیون کنجاله دانه تشکیل می شوند و به عنوان اثرات قارچ کش، باکتری کش، نماتد کش و حشره کش و همچنین خواص دیگر از جمله اثرات حسی شیمیایی و خواص شیمی درمانی، شناخته شده اند. 70.مطالعات متعدد نشان داده است که گیاهان خردل و پودر دانه به طور موثری به عنوان ضدعفونی کننده در برابر آفات خاک و مواد غذایی ذخیره شده عمل می کنند 57،59،71،72.در این مطالعه، ما سمیت کنجاله چهار دانه و سه محصول زیست فعال آن AITC، BITC و 4-HBITC را برای لارو پشه Aedes ارزیابی کردیم.Aedes Aegypti.انتظار می رود افزودن پودر دانه به طور مستقیم به آب حاوی لارو پشه، فرآیندهای آنزیمی را فعال کند که ایزوتیوسیانات هایی را که برای لارو پشه سمی هستند تولید می کند.این تبدیل زیستی تا حدی با فعالیت لاروکشی مشاهده شده در کنجاله دانه و از دست دادن فعالیت حشره کشی زمانی که کنجاله دانه خردل کوتوله قبل از استفاده تحت عملیات حرارتی قرار گرفت، نشان داده شد.انتظار می‌رود که عملیات حرارتی آنزیم‌های هیدرولیتیکی را که گلوکوزینولات‌ها را فعال می‌کنند از بین ببرد و در نتیجه از تشکیل ایزوتیوسیانات‌های فعال زیستی جلوگیری کند.این اولین مطالعه ای است که خواص حشره کشی پودر دانه کلم را در برابر پشه ها در محیط های آبی تایید می کند.
در بین پودرهای بذر آزمایش شده، پودر بذر شاهی آبی (Ls) سمی ترین بود که باعث مرگ و میر بالای Aedes albopictus شد.لاروهای Aedes aegypti به مدت 24 ساعت به طور مداوم پردازش شدند.سه پودر دانه باقیمانده (PG، IG و DFP) فعالیت کندتری داشتند و پس از 72 ساعت درمان مداوم همچنان باعث مرگ و میر قابل توجهی شدند.فقط کنجاله دانه Ls حاوی مقادیر قابل توجهی گلوکوزینولات بود، در حالی که PG و DFP حاوی میروزیناز و IG حاوی گلوکوزینولات به عنوان گلوکوزینولات اصلی بودند (جدول 1).گلوکوتروپائئولین به BITC و سینالبین به 4-HBITC61,62 هیدرولیز می شود.نتایج زیست سنجی ما نشان می دهد که هم پودر دانه Ls و هم BITC مصنوعی برای لارو پشه بسیار سمی هستند.جزء اصلی کنجاله دانه PG و DFP میروزیناز گلوکوزینولات است که به AITC هیدرولیز می شود.AITC در از بین بردن لارو پشه با مقدار LC50 ppm 19.35 موثر است.در مقایسه با AITC و BITC، ایزوتیوسیانات 4-HBITC کمترین سمیت را برای لارو دارد.اگرچه AITC کمتر از BITC سمی است، اما مقادیر LC50 آنها کمتر از بسیاری از اسانس های آزمایش شده بر روی لارو پشه 32،73،74،75 است.
پودر دانه چلیپایی ما برای استفاده در برابر لارو پشه حاوی یک گلوکوزینولات اصلی است که بیش از 98-99٪ از کل گلوکوزینولات ها را که توسط HPLC تعیین می شود، تشکیل می دهد.مقادیر کمی از گلوکوزینولات های دیگر شناسایی شد، اما سطح آنها کمتر از 0.3٪ از کل گلوکوزینولات ها بود.پودر بذر شاهی (L. sativum) حاوی گلوکوزینولات های ثانویه (سینیگرین) است، اما نسبت آنها 1% کل گلوکوزینولات ها است و مقدار آنها هنوز ناچیز است (حدود 0.4 میلی گرم در گرم پودر دانه).اگرچه PG و DFP حاوی همان گلوکوزینولات اصلی (میروزین) هستند، فعالیت لاروکشی کنجاله دانه آنها به دلیل مقادیر LC50 آنها به طور قابل توجهی متفاوت است.سمیت برای سفیدک پودری متفاوت است.ظهور لاروهای Aedes aegypti ممکن است به دلیل تفاوت در فعالیت میروزیناز یا پایداری بین دو خوراک بذر باشد.فعالیت میروزیناز نقش مهمی در فراهمی زیستی محصولات هیدرولیز مانند ایزوتیوسیانات ها در گیاهان Brassicaceae ایفا می کند.گزارش های قبلی توسط پوکاک و همکاران 77 و ویلکینسون و همکاران 78 نشان داده اند که تغییرات در فعالیت و پایداری میروزیناز نیز ممکن است با عوامل ژنتیکی و محیطی مرتبط باشد.
محتوای ایزوتیوسیانات زیست فعال مورد انتظار بر اساس مقادیر LC50 هر کنجاله دانه در 24 و 72 ساعت (جدول 5) برای مقایسه با کاربردهای شیمیایی مربوطه محاسبه شد.پس از 24 ساعت، ایزوتیوسیانات های موجود در پودر دانه سمی تر از ترکیبات خالص بودند.مقادیر LC50 محاسبه شده بر اساس قسمت در میلیون (ppm) تیمار بذر ایزوتیوسیانات کمتر از مقادیر LC50 برای کاربردهای BITC، AITC و 4-HBITC بود.ما لاروهایی را مشاهده کردیم که گلوله های پودر دانه را مصرف می کردند (شکل 3A).در نتیجه، لاروها ممکن است با مصرف قرص‌های آرد بذر، در معرض ایزوتیوسیانات‌های سمی قرار بگیرند.این بیشتر در تیمارهای کنجاله دانه IG و PG در مواجهه 24 ساعته مشهود بود، جایی که غلظت LC50 به ترتیب 75 و 72 درصد کمتر از تیمارهای AITC خالص و 4-HBITC بود.تیمارهای Ls و DFP نسبت به ایزوتیوسیانات خالص سمی تر بودند و مقادیر LC50 به ترتیب 24% و 41% کمتر بودند.لاروها در تیمار شاهد با موفقیت شفیره شدند (شکل 3B)، در حالی که اکثر لاروها در تیمار کنجاله بذر شفیره نشدند و رشد لارو به طور قابل توجهی به تاخیر افتاد (شکل 3B,D).در Spodopteralitura، ایزوتیوسیانات ها با تاخیر رشد و تاخیر رشد همراه هستند.
لارو Ae.پشه های Aedes aegypti به مدت 24 تا 72 ساعت به طور مداوم در معرض پودر دانه براسیکا قرار گرفتند.(الف) لاروهای مرده با ذرات آرد دانه در قسمت های دهان (دایره شده)؛(ب) تیمار کنترل (dH20 بدون پودر دانه اضافه شده) نشان می دهد که لاروها به طور طبیعی رشد می کنند و بعد از 72 ساعت شروع به شفیره شدن می کنند (C, D) لاروهای تیمار شده با پودر دانه.کنجاله دانه تفاوت هایی را در رشد نشان داد و شفیره نشد.
ما مکانیسم اثرات سمی ایزوتیوسیانات ها بر روی لارو پشه را مطالعه نکرده ایم.با این حال، مطالعات قبلی روی مورچه های آتشین قرمز (Solenopsis invicta) نشان داده است که مهار گلوتاتیون S-ترانسفراز (GST) و استراز (EST) مکانیسم اصلی زیست فعالی ایزوتیوسیانات است و AITC، حتی در فعالیت کم، می تواند فعالیت GST را نیز مهار کند. .مورچه های آتشین قرمز وارداتی در غلظت های پاییندوز 0.5 میکروگرم بر میلی لیتر 80 است.در مقابل، AITC استیل کولین استراز را در شپشک های ذرت بالغ (Sitophilus zeamais) مهار می کند.مطالعات مشابهی باید برای روشن شدن مکانیسم فعالیت ایزوتیوسیانات در لارو پشه انجام شود.
ما از درمان DFP غیرفعال شده با حرارت استفاده می کنیم تا از این پیشنهاد حمایت کنیم که هیدرولیز گلوکوزینولات های گیاهی برای تشکیل ایزوتیوسیانات های فعال به عنوان مکانیزمی برای کنترل لارو پشه توسط کنجاله دانه خردل عمل می کند.کنجاله دانه DFP-HT در میزان کاربرد آزمایش شده سمی نبود.لافارگا و همکاران82 گزارش کردند که گلوکوزینولات ها به تخریب در دماهای بالا حساس هستند.همچنین انتظار می‌رود که عملیات حرارتی آنزیم میروزیناز در کنجاله بذر را دناتوره کند و از هیدرولیز گلوکوزینولات‌ها برای تشکیل ایزوتیوسیانات‌های فعال جلوگیری کند.این موضوع توسط Okunade و همکاران نیز تایید شد.75 نشان داد که میروزیناز به دما حساس است، نشان می دهد که فعالیت میروزیناز زمانی که خردل، خردل سیاه و دانه های ریشه خونی در دمای بالاتر از 80 درجه قرار گرفتند به طور کامل غیرفعال شد.ج. این مکانیسم‌ها ممکن است منجر به از دست دادن فعالیت حشره‌کشی کنجاله دانه DFP شود.
بنابراین، کنجاله دانه خردل و سه ایزوتیوسیانات اصلی آن برای لارو پشه سمی هستند.با توجه به این تفاوت ها بین پودر دانه و تیمارهای شیمیایی، استفاده از پودر دانه ممکن است یک روش موثر برای کنترل پشه باشد.نیاز به شناسایی فرمولاسیون های مناسب و سیستم های تحویل موثر برای بهبود کارایی و پایداری استفاده از پودرهای بذر وجود دارد.نتایج ما نشان دهنده استفاده بالقوه از کنجاله دانه خردل به عنوان جایگزینی برای آفت کش های مصنوعی است.این فناوری می تواند به ابزاری نوآورانه برای کنترل ناقلان پشه تبدیل شود.از آنجایی که لارو پشه در محیط‌های آبی رشد می‌کند و گلوکوزینولات‌های کنجاله بذر به صورت آنزیمی به ایزوتیوسیانات‌های فعال تبدیل می‌شوند، استفاده از کنجاله دانه خردل در آب آلوده به پشه پتانسیل کنترل قابل‌توجهی را ارائه می‌دهد.اگرچه فعالیت لاروکشی ایزوتیوسیانات ها متفاوت است (BITC > AITC > 4-HBITC)، تحقیقات بیشتری برای تعیین اینکه آیا ترکیب کنجاله دانه با چندین گلوکوزینولات به طور هم افزایی باعث افزایش سمیت می شود، مورد نیاز است.این اولین مطالعه ای است که اثرات حشره کشی کنجاله دانه چلیپایی بدون چربی و سه ایزوتیوسیانات زیست فعال را بر روی پشه ها نشان می دهد.نتایج این مطالعه با نشان دادن اینکه کنجاله دانه کلم بدون چربی، محصول جانبی استخراج روغن از دانه‌ها، می‌تواند به عنوان یک عامل لاروکشی امیدوارکننده برای کنترل پشه عمل کند.این اطلاعات می تواند به کشف بیشتر عوامل کنترل زیستی گیاهی و توسعه آنها به عنوان آفت کش های زیستی ارزان، کاربردی و سازگار با محیط زیست کمک کند.
مجموعه داده های تولید شده برای این مطالعه و تجزیه و تحلیل های حاصل از نویسنده مربوطه در صورت درخواست معقول در دسترس است.در پایان مطالعه کلیه مواد مورد استفاده در مطالعه (حشرات و پودر دانه) از بین رفت.