فعالیت بیولوژیکی پودر دانه کلم و ترکیبات آن به عنوان یک لاروکش سازگار با محیط زیست در برابر پشه‌ها

به طور مؤثرکنترل پشه‌هاو کاهش بروز بیماری‌هایی که آنها حمل می‌کنند، به جایگزین‌های استراتژیک، پایدار و سازگار با محیط زیست برای آفت‌کش‌های شیمیایی نیاز است. ما کنجاله‌های دانه‌ای از برخی از خانواده Brassicaceae (خانواده Brassica) را به عنوان منبعی از ایزوتیوسیانات‌های مشتق شده از گیاه که توسط هیدرولیز آنزیمی گلوکوزینولات‌های غیرفعال بیولوژیکی تولید می‌شوند، برای استفاده در کنترل پشه‌های مصری (L., 1762) ارزیابی کردیم. پودر دانه پنج دانه بدون چربی (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 و Thlaspi arvense - سه نوع اصلی غیرفعال سازی حرارتی و تخریب آنزیمی. محصولات شیمیایی برای تعیین سمیت (LC50) آلیل ایزوتیوسیانات، بنزیل ایزوتیوسیانات و 4-هیدروکسی بنزیل ایزوتیوسیانات برای لارو Aedes aegypti در معرض قرار گرفتن 24 ساعته = 0.04 گرم در 120 میلی لیتر dH2O). مقادیر LC50 برای خردل، خردل سفید و دم اسبی. پودر دانه در مقایسه با آلیل ایزوتیوسیانات (LC50 = 19.35 ppm) و 4. هیدروکسی بنزیل ایزوتیوسیانات (LC50 = 55.41 ppm) به ترتیب 0.05، 0.08 و 0.05 بود. -هیدروکسی بنزیل ایزوتیوسیانات (LC50 = 55.41 ppm) به ترتیب 24 ساعت پس از تیمار برای لاروها سمی‌تر از 0.1 گرم در 120 میلی‌لیتر dH2O بود. این نتایج با تولید پودر دانه یونجه سازگار است. راندمان بالاتر بنزیل استرها با مقادیر LC50 محاسبه شده مطابقت دارد. استفاده از پودر دانه می‌تواند یک روش مؤثر برای کنترل پشه‌ها باشد. اثربخشی پودر دانه کلم و اجزای شیمیایی اصلی آن در برابر لارو پشه را نشان می‌دهد و نشان می‌دهد که چگونه ترکیبات طبیعی موجود در پودر دانه کلم می‌تواند به عنوان یک لاروکش سازگار با محیط زیست امیدوارکننده برای کنترل پشه عمل کند.
بیماری‌های منتقله از طریق ناقلین ناشی از پشه‌های آئدس همچنان یک مشکل عمده بهداشت عمومی جهانی است. میزان بروز بیماری‌های منتقله از طریق پشه از نظر جغرافیایی گسترش می‌یابد1،2،3 و دوباره ظاهر می‌شود و منجر به شیوع بیماری‌های شدید می‌شود4،5،6،7. شیوع بیماری‌ها در بین انسان‌ها و حیوانات (مانند چیکونگونیا، تب دنگی، تب دره ریفت، تب زرد و ویروس زیکا) بی‌سابقه است. تب دنگی به تنهایی تقریباً 3.6 میلیارد نفر را در مناطق گرمسیری در معرض خطر عفونت قرار می‌دهد، و تخمین زده می‌شود که سالانه 390 میلیون عفونت رخ می‌دهد که منجر به 6100 تا 24300 مرگ در سال می‌شود8. ظهور مجدد و شیوع ویروس زیکا در آمریکای جنوبی به دلیل آسیب مغزی که در کودکان متولد شده از زنان آلوده ایجاد می‌کند، توجه جهانی را به خود جلب کرده است2. کرمر و همکاران 3 پیش‌بینی می‌کنند که محدوده جغرافیایی پشه‌های آئدس همچنان در حال گسترش خواهد بود و تا سال 2050، نیمی از جمعیت جهان در معرض خطر عفونت توسط آربوویروس‌های منتقله از طریق پشه قرار خواهند گرفت.
به استثنای واکسن‌های اخیراً توسعه‌یافته علیه تب دنگی و تب زرد، واکسن‌هایی علیه اکثر بیماری‌های منتقله از پشه هنوز توسعه نیافته‌اند9،10،11. واکسن‌ها هنوز در مقادیر محدود در دسترس هستند و فقط در آزمایش‌های بالینی استفاده می‌شوند. کنترل ناقلین پشه با استفاده از حشره‌کش‌های مصنوعی یک استراتژی کلیدی برای کنترل شیوع بیماری‌های منتقله از پشه بوده است12،13. اگرچه آفت‌کش‌های مصنوعی در کشتن پشه‌ها مؤثر هستند، اما استفاده مداوم از آفت‌کش‌های مصنوعی بر موجودات غیرهدف تأثیر منفی می‌گذارد و محیط زیست را آلوده می‌کند14،15،16. روند افزایش مقاومت پشه‌ها در برابر حشره‌کش‌های شیمیایی حتی نگران‌کننده‌تر است17،18،19. این مشکلات مرتبط با آفت‌کش‌ها، جستجو برای جایگزین‌های مؤثر و سازگار با محیط زیست برای کنترل ناقلین بیماری را تسریع کرده است.
گیاهان مختلفی به عنوان منابع آفت‌کش‌های گیاهی برای کنترل آفات توسعه یافته‌اند20،21. مواد گیاهی عموماً سازگار با محیط زیست هستند زیرا زیست‌تخریب‌پذیر هستند و سمیت کم یا ناچیزی برای موجودات غیرهدف مانند پستانداران، ماهی‌ها و دوزیستان دارند20،22. ترکیبات گیاهی به عنوان تولید کننده انواع ترکیبات فعال زیستی با مکانیسم‌های مختلف عمل برای کنترل مؤثر مراحل مختلف زندگی پشه‌ها شناخته شده‌اند23،24،25،26. ترکیبات مشتق شده از گیاهان مانند روغن‌های ضروری و سایر مواد فعال گیاهی مورد توجه قرار گرفته‌اند و راه را برای ابزارهای نوآورانه برای کنترل ناقلین پشه هموار کرده‌اند. روغن‌های ضروری، مونوترپن‌ها و سسکوئی‌ترپن‌ها به عنوان دافع، بازدارنده تغذیه و تخم‌کش عمل می‌کنند27،28،29،30،31،32،33. بسیاری از روغن‌های گیاهی باعث مرگ لارو، شفیره و پشه بالغ می‌شوند34،35،36 و بر سیستم‌های عصبی، تنفسی، غدد درون‌ریز و سایر سیستم‌های مهم حشرات تأثیر می‌گذارند37.
مطالعات اخیر، بینشی در مورد استفاده بالقوه از گیاهان خردل و دانه‌های آنها به عنوان منبعی از ترکیبات فعال زیستی ارائه داده‌اند. پودر دانه خردل به عنوان یک ماده ضدعفونی‌کننده زیستی38،39،40،41 آزمایش شده و به عنوان اصلاح‌کننده خاک برای سرکوب علف‌های هرز42،43،44 و کنترل عوامل بیماری‌زای گیاهی خاکزاد45،46،47،48،49،50، تغذیه گیاه استفاده شده است. نماتدها41،51، 52، 53، 54 و آفات55، 56، 57، 58، 59، 60. فعالیت قارچ‌کشی این پودرهای دانه به ترکیبات محافظ گیاه به نام ایزوتیوسیانات‌ها38،42،60 نسبت داده می‌شود. در گیاهان، این ترکیبات محافظ به شکل گلوکوزینولات‌های غیر فعال زیستی در سلول‌های گیاهی ذخیره می‌شوند. با این حال، هنگامی که گیاهان در اثر تغذیه حشرات یا عفونت پاتوژن آسیب می‌بینند، گلوکوزینولات‌ها توسط میروزیناز به ایزوتیوسیانات‌های زیست‌فعال هیدرولیز می‌شوند55،61. ایزوتیوسیانات‌ها ترکیبات فراری هستند که به داشتن فعالیت ضدمیکروبی و حشره‌کشی طیف گسترده معروفند و ساختار، فعالیت بیولوژیکی و محتوای آنها در بین گونه‌های خانواده‌ی براسیکاسه بسیار متفاوت است42،59،62،63.
اگرچه ایزوتیوسیانات‌های مشتق شده از پودر دانه خردل به داشتن فعالیت حشره‌کشی معروف هستند، اما داده‌های مربوط به فعالیت بیولوژیکی علیه ناقلین بندپایان مهم از نظر پزشکی کم است. مطالعه ما فعالیت لاروکشی چهار پودر دانه بدون چربی را در برابر پشه‌های آئدس بررسی کرد. لاروهای آئدس اجیپتی. هدف از این مطالعه ارزیابی کاربرد بالقوه آنها به عنوان آفت‌کش‌های زیستی سازگار با محیط زیست برای کنترل پشه بود. سه جزء شیمیایی اصلی پودر دانه، آلیل ایزوتیوسیانات (AITC)، بنزیل ایزوتیوسیانات (BITC) و 4-هیدروکسی بنزیل ایزوتیوسیانات (4-HBITC) نیز برای بررسی فعالیت بیولوژیکی این اجزای شیمیایی بر روی لارو پشه مورد آزمایش قرار گرفتند. این اولین گزارشی است که اثربخشی چهار پودر دانه کلم و اجزای شیمیایی اصلی آنها را در برابر لارو پشه ارزیابی می‌کند.
کلونی‌های آزمایشگاهی Aedes aegypti (سویه راکفلر) در دمای 26 درجه سانتیگراد، رطوبت نسبی 70٪ (RH) و 10:14 ساعت (دوره نوری روشنایی: تاریکی) نگهداری شدند. ماده‌های جفت‌گیری کرده در قفس‌های پلاستیکی (ارتفاع 11 سانتی‌متر و قطر 9.5 سانتی‌متر) قرار داده شدند و از طریق سیستم تغذیه بطری با استفاده از خون سیتراته گاو (HemoStat Laboratories Inc.، دیکسون، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) تغذیه شدند. تغذیه خون طبق معمول با استفاده از یک تغذیه‌کننده چند شیشه‌ای غشایی (Chemglass، Life Sciences LLC، Vineland، نیوجرسی، ایالات متحده آمریکا) متصل به یک لوله حمام آب در گردش (HAAKE S7، Thermo-Scientific، Waltham، MA، ایالات متحده آمریکا) با کنترل دما 37 درجه سانتیگراد انجام شد. یک لایه نازک از Parafilm M را روی کف هر محفظه تغذیه شیشه‌ای (مساحت 154 میلی‌متر مربع) بکشید. سپس هر تغذیه‌کننده روی شبکه بالایی که قفس حاوی ماده جفت‌گیری کننده را پوشانده بود، قرار گرفت. تقریباً 350 تا 400 میکرولیتر خون گاو با استفاده از پیپت پاستور (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) به یک قیف تغذیه‌کننده شیشه‌ای اضافه شد و به کرم‌های بالغ حداقل یک ساعت اجازه داده شد تا خونشان تخلیه شود. سپس به ماده‌های باردار محلول 10٪ ساکارز داده شد و اجازه داده شد تا تخم‌های خود را روی کاغذ صافی مرطوب که در فنجان‌های سوفله فوق‌العاده شفاف جداگانه (اندازه 1.25 اونس مایع، Dart Container Corp., Mason, MI, USA) قرار داده شده بود، بگذارند. در قفس با آب قرار داده شد. کاغذ صافی حاوی تخم‌ها را در یک کیسه دربسته (SC Johnsons, Racine, WI) قرار دهید و در دمای 26 درجه سانتیگراد نگهداری کنید. تخم‌ها تفریخ شدند و تقریباً 200 تا 250 لارو در سینی‌های پلاستیکی حاوی مخلوطی از غذای خرگوش (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) و پودر کبد (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA) پرورش داده شدند. و فیله ماهی (TetraMin، Tetra GMPH، Meer، آلمان) به نسبت ۲:۱:۱. لاروهای اواخر سن سوم در زیست‌سنجی‌های ما استفاده شدند.
بذر گیاهی مورد استفاده در این مطالعه از منابع تجاری و دولتی زیر تهیه شد: Brassica juncea (خردل قهوه‌ای-Pacific Gold) و Brassica juncea (خردل سفید-Ida Gold) از شرکت تعاونی کشاورزان شمال غربی اقیانوس آرام، ایالت واشنگتن، ایالات متحده؛ (Garden Cress) از Kelly Seed and Hardware Co.، پیوریا، ایلینوی، ایالات متحده و Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) از USDA-ARS، پیوریا، ایلینوی، ایالات متحده؛ هیچ یک از بذرهای مورد استفاده در این مطالعه با آفت‌کش‌ها تیمار نشدند. تمام بذرها مطابق با مقررات محلی و ملی و با رعایت تمام مقررات محلی و ملی مربوطه فرآوری و استفاده شدند. این مطالعه گونه‌های گیاهی تراریخته را بررسی نکرد.
دانه‌های Brassica juncea (PG)، یونجه (Ls)، خردل سفید (IG)، Thlaspi arvense (DFP) با استفاده از آسیاب فوق گریز از مرکز Retsch ZM200 (Retsch، Haan، آلمان) مجهز به مش 0.75 میلی‌متری و روتور فولادی ضد زنگ، 12 دندانه، 10000 دور در دقیقه (جدول 1) به پودر ریز تبدیل شدند. پودر دانه آسیاب شده به یک انگشتک کاغذی منتقل شد و به مدت 24 ساعت در دستگاه سوکسله با هگزان چربی‌زدایی شد. یک نمونه فرعی از خردل مزرعه‌ای چربی‌زدایی شده به مدت 1 ساعت در دمای 100 درجه سانتیگراد تحت عملیات حرارتی قرار گرفت تا میروزیناز دناتوره شود و از هیدرولیز گلوکوزینولات‌ها برای تشکیل ایزوتیوسیانات‌های فعال بیولوژیکی جلوگیری شود. پودر دانه دم اسبی حرارت دیده (DFP-HT) به عنوان کنترل منفی با دناتوره کردن میروزیناز استفاده شد.
محتوای گلوکوزینولات پودر دانه بدون چربی با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) طبق پروتکل 64 که قبلاً منتشر شده بود، در سه تکرار تعیین شد. به طور خلاصه، 3 میلی‌لیتر متانول به یک نمونه 250 میلی‌گرمی از پودر دانه بدون چربی اضافه شد. هر نمونه به مدت 30 دقیقه در حمام آب با امواج فراصوت قرار داده شد و به مدت 16 ساعت در تاریکی با دمای 23 درجه سانتیگراد قرار داده شد. سپس یک میلی‌لیتر از لایه آلی از طریق یک فیلتر 0.45 میکرومتری به یک نمونه‌گیر خودکار فیلتر شد. با استفاده از یک سیستم HPLC Shimadzu (دو پمپ LC 20AD؛ نمونه‌گیر خودکار SIL 20A؛ گاززدای DGU 20As؛ آشکارساز UV-VIS SPD-20A برای نظارت در طول موج 237 نانومتر؛ و ماژول گذرگاه ارتباطی CBM-20A)، محتوای گلوکوزینولات پودر دانه در سه تکرار تعیین شد. با استفاده از نرم‌افزار Shimadzu LC Solution نسخه 1.25 (شرکت Shimadzu، کلمبیا، مریلند، ایالات متحده آمریکا). ستون یک ستون فاز معکوس C18 Inertsil (250 میلی‌متر × 4.6 میلی‌متر؛ RP C-18، ODS-3، 5u؛ GL Sciences، Torrance، CA، ایالات متحده آمریکا) بود. شرایط اولیه فاز متحرک بر روی 12٪ متانول/88٪ 0.01 M تترابوتیل آمونیوم هیدروکسید در آب (TBAH؛ سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) با سرعت جریان 1 میلی‌لیتر در دقیقه تنظیم شد. پس از تزریق 15 میکرولیتر نمونه، شرایط اولیه به مدت 20 دقیقه حفظ شد و سپس نسبت حلال به 100٪ متانول تنظیم شد و زمان کل آنالیز نمونه 65 دقیقه بود. یک منحنی استاندارد (مبتنی بر nM/mAb) با رقیق‌سازی‌های سریالی از استانداردهای سیناپین، گلوکوزینولات و میروزین تازه تهیه شده (سیگما-آلدریچ، سنت لوئیس، میسوری، ایالات متحده) برای تخمین میزان گوگرد پودر دانه بدون چربی تهیه شد. گلوکوزینولات‌ها. غلظت گلوکوزینولات در نمونه‌ها با استفاده از نسخه OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) مجهز به همان ستون و با استفاده از روشی که قبلاً شرح داده شده بود، روی یک دستگاه HPLC مدل Agilent 1100 (Agilent، سانتا کلارا، کالیفرنیا، ایالات متحده) آزمایش شد. غلظت گلوکوزینولات تعیین شد؛ باید بین سیستم‌های HPLC قابل مقایسه باشد.
آلیل ایزوتیوسیانات (94٪، پایدار) و بنزیل ایزوتیوسیانات (98٪) از شرکت فیشر ساینتیفیک (ترمو فیشر ساینتیفیک، والتهام، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. 4-هیدروکسی بنزیل ایزوتیوسیانات از شرکت کم کروز (سانتا کروز بیوتکنولوژی، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. گلوکوزینولات‌ها، گلوکوزینولات‌ها و گلوکوزینولات‌ها پس از هیدرولیز آنزیمی توسط میروزیناز، به ترتیب آلیل ایزوتیوسیانات، بنزیل ایزوتیوسیانات و 4-هیدروکسی بنزیل ایزوتیوسیانات را تشکیل می‌دهند.
زیست‌سنجی‌های آزمایشگاهی طبق روش موتوری و همکاران 32 با اصلاحاتی انجام شد. در این مطالعه از پنج خوراک دانه کم‌چرب استفاده شد: DFP، DFP-HT، IG، PG و Ls. بیست لارو در یک بشر سه‌راهه یکبار مصرف 400 میلی‌لیتری (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) حاوی 120 میلی‌لیتر آب دیونیزه (dH2O) قرار داده شدند. هفت غلظت پودر دانه برای سمیت لارو پشه آزمایش شد: 0.01، 0.02، 0.04، 0.06، 0.08، 0.1 و 0.12 گرم پودر دانه / 120 میلی‌لیتر dH2O برای پودر دانه DFP، DFP-HT، IG و PG. زیست‌سنجی‌های اولیه نشان می‌دهد که آرد دانه Ls بدون چربی نسبت به چهار آرد دانه دیگر آزمایش شده سمی‌تر است. بنابراین، ما هفت غلظت تیماری پودر دانه Ls را به غلظت‌های زیر تنظیم کردیم: 0.015، 0.025، 0.035، 0.045، 0.055، 0.065 و 0.075 گرم در 120 میلی‌لیتر dH2O.
یک گروه کنترل بدون تیمار (dH20، بدون مکمل آرد دانه) برای ارزیابی مرگ و میر طبیعی حشرات تحت شرایط آزمایش در نظر گرفته شد. زیست‌سنجی‌های سم‌شناسی برای هر وعده غذایی دانه شامل سه بشر سه شیبه تکراری (20 لارو سن سوم در هر بشر) برای مجموع 108 ویال بود. ظروف تیمار شده در دمای اتاق (20-21 درجه سانتیگراد) نگهداری شدند و مرگ و میر لاروها در طول 24 و 72 ساعت قرار گرفتن مداوم در معرض غلظت‌های تیمار ثبت شد. اگر بدن و زائده‌های پشه هنگام سوراخ شدن یا لمس با یک کاردک نازک از جنس استیل ضد زنگ حرکت نکنند، لاروهای پشه مرده در نظر گرفته می‌شوند. لاروهای مرده معمولاً در حالت پشتی یا شکمی در کف ظرف یا روی سطح آب بی‌حرکت باقی می‌مانند. این آزمایش سه بار در روزهای مختلف با استفاده از گروه‌های مختلف لارو تکرار شد، در مجموع 180 لارو در معرض هر غلظت تیمار قرار گرفتند.
سمیت AITC، BITC و 4-HBITC برای لارو پشه با استفاده از همان روش زیست‌سنجی اما با تیمارهای مختلف ارزیابی شد. محلول‌های استوک 100000 ppm را برای هر ماده شیمیایی با اضافه کردن 100 میکرولیتر از ماده شیمیایی به 900 میکرولیتر اتانول مطلق در یک لوله سانتریفیوژ 2 میلی‌لیتری و تکان دادن به مدت 30 ثانیه برای مخلوط شدن کامل، تهیه کنید. غلظت‌های تیمار بر اساس زیست‌سنجی‌های اولیه ما تعیین شدند که نشان داد BITC بسیار سمی‌تر از AITC و 4-HBITC است. برای تعیین سمیت، 5 غلظت BITC (1، 3، 6، 9 و 12 ppm)، 7 غلظت AITC (5، 10، 15، 20، 25، 30 و 35 ppm) و 6 غلظت 4-HBITC (15، 15، 20، 25، 30 و 35 ppm) استفاده شد. (30، 45، 60، 75 و 90 ppm). به تیمار شاهد 108 میکرولیتر اتانول مطلق تزریق شد که معادل حداکثر حجم تیمار شیمیایی است. زیست‌سنجی‌ها مانند بالا تکرار شدند و در مجموع 180 لارو در هر غلظت تیمار قرار داده شدند. مرگ و میر لاروها برای هر غلظت AITC، BITC و 4-HBITC پس از 24 ساعت قرار گرفتن مداوم در معرض این ترکیبات ثبت شد.
تجزیه و تحلیل پروبیت 65 داده مرگ و میر مرتبط با دوز با استفاده از نرم‌افزار Polo (Polo Plus، نرم‌افزار LeOra، نسخه 1.0) برای محاسبه غلظت کشنده 50٪ (LC50)، غلظت کشنده 90٪ (LC90)، شیب، ضریب دوز کشنده و غلظت کشنده 95٪ انجام شد. این محاسبات بر اساس فواصل اطمینان برای نسبت‌های دوز کشنده برای منحنی‌های غلظت تبدیل لگاریتمی و دوز-مرگ و میر انجام شد. داده‌های مرگ و میر بر اساس داده‌های تکرار ترکیبی 180 لارو در معرض هر غلظت درمانی است. تجزیه و تحلیل‌های احتمالی به طور جداگانه برای هر پودر دانه و هر جزء شیمیایی انجام شد. بر اساس فاصله اطمینان 95٪ نسبت دوز کشنده، سمیت پودر دانه و اجزای شیمیایی برای لارو پشه به طور قابل توجهی متفاوت در نظر گرفته شد، بنابراین فاصله اطمینان حاوی مقدار 1 تفاوت معنی داری نداشت، P = 0.0566.
نتایج HPLC برای تعیین گلوکوزینولات‌های اصلی در آردهای دانه بدون چربی DFP، IG، PG و Ls در جدول 1 فهرست شده‌اند. گلوکوزینولات‌های اصلی در آردهای دانه مورد آزمایش به استثنای DFP و PG که هر دو حاوی گلوکوزینولات‌های میروزیناز بودند، متفاوت بودند. میزان میروزینین در PG بیشتر از DFP بود، به ترتیب 33.3 ± 1.5 و 26.5 ± 0.9 میلی‌گرم بر گرم. پودر دانه Ls حاوی 36.6 ± 1.2 میلی‌گرم بر گرم گلوکوگلیکون بود، در حالی که پودر دانه IG حاوی 38.0 ± 0.5 میلی‌گرم بر گرم سیناپین بود.
لارو پشه‌های Ae. Aedes aegypti هنگام تیمار با پودر دانه بدون چربی کشته شدند، اگرچه اثربخشی درمان بسته به گونه گیاهی متفاوت بود. فقط DFP-NT پس از 24 و 72 ساعت قرار گرفتن در معرض پودر دانه، برای لارو پشه سمی نبود (جدول 2). سمیت پودر دانه فعال با افزایش غلظت افزایش یافت (شکل 1A، B). سمیت پودر دانه برای لارو پشه بر اساس 95٪ CI نسبت دوز کشنده مقادیر LC50 در ارزیابی‌های 24 ساعته و 72 ساعته به طور قابل توجهی متفاوت بود (جدول 3). پس از 24 ساعت، اثر سمی پودر دانه Ls بیشتر از سایر تیمارهای پودر دانه بود، با بیشترین فعالیت و حداکثر سمیت برای لارو (LC50 = 0.04 گرم در 120 میلی لیتر dH2O). لاروها در مقایسه با تیمارهای پودر دانه IG، Ls و PG، در 24 ساعت نسبت به DFP حساسیت کمتری داشتند، به طوری که مقادیر LC50 به ترتیب 0.115، 0.04 و 0.08 گرم در 120 میلی‌لیتر dH2O بودند که از نظر آماری بالاتر از مقدار LC50 0.211 گرم در 120 میلی‌لیتر dH2O بودند (جدول 3). مقادیر LC90 DFP، IG، PG و Ls به ترتیب 0.376، 0.275، 0.137 و 0.074 گرم در 120 میلی‌لیتر dH2O بودند (جدول 2). بالاترین غلظت DPP، 0.12 گرم در 120 میلی‌لیتر dH2O بود. پس از 24 ساعت ارزیابی، میانگین مرگ و میر لاروها تنها 12٪ بود، در حالی که میانگین مرگ و میر لاروهای IG و PG به ترتیب به 51٪ و 82٪ رسید. پس از 24 ساعت ارزیابی، میانگین مرگ و میر لاروها برای بالاترین غلظت تیمار پودر دانه Ls (0.075 گرم در 120 میلی لیتر dH2O) 99٪ بود (شکل 1A).
منحنی‌های مرگ و میر از پاسخ دوز (Probit) لاروهای Ae. Egyptian (لاروهای سن سوم) به غلظت پودر دانه 24 ساعت (A) و 72 ساعت (B) پس از تیمار تخمین زده شدند. خط چین نشان دهنده LC50 تیمار پودر دانه است. DFP Thlaspi arvense، DFP-HT Thlaspi arvense غیرفعال شده با حرارت، IG Sinapsis alba (Ida Gold)، PG Brassica juncea (Pacific Gold)، Ls Lepidium sativum.
در ارزیابی ۷۲ ساعته، مقادیر LC50 پودر دانه DFP، IG و PG به ترتیب ۰.۱۱۱، ۰.۰۸۵ و ۰.۰۵۱ گرم در ۱۲۰ میلی‌لیتر dH2O بود. تقریباً تمام لاروهایی که در معرض پودر دانه Ls قرار گرفتند پس از ۷۲ ساعت مواجهه مردند، بنابراین داده‌های مرگ و میر با آنالیز پروبیت مغایرت داشت. در مقایسه با سایر پودرهای دانه، لاروها نسبت به تیمار پودر دانه DFP حساسیت کمتری داشتند و از نظر آماری مقادیر LC50 بالاتری داشتند (جداول ۲ و ۳). پس از ۷۲ ساعت، مقادیر LC50 برای تیمارهای پودر دانه DFP، IG و PG به ترتیب ۰.۱۱۱، ۰.۰۸۵ و ۰.۰۵ گرم در ۱۲۰ میلی‌لیتر dH2O تخمین زده شد. پس از ۷۲ ساعت ارزیابی، مقادیر LC90 پودر دانه DFP، IG و PG به ترتیب ۰.۲۱۵، ۰.۲۵۴ و ۰.۱۳۸ گرم در ۱۲۰ میلی‌لیتر dH2O بود. پس از 72 ساعت ارزیابی، میانگین مرگ و میر لارو برای تیمارهای پودر دانه DFP، IG و PG در حداکثر غلظت 0.12 گرم در 120 میلی لیتر dH2O به ترتیب 58٪، 66٪ و 96٪ بود (شکل 1B). پس از ارزیابی 72 ساعته، مشخص شد که پودر دانه PG سمی‌تر از پودر دانه IG و DFP است.
ایزوتیوسیانات‌های مصنوعی، آلیل ایزوتیوسیانات (AITC)، بنزیل ایزوتیوسیانات (BITC) و 4-هیدروکسی بنزیل ایزوتیوسیانات (4-HBITC) می‌توانند به طور موثری لارو پشه را از بین ببرند. در 24 ساعت پس از تیمار، BITC با مقدار LC50 برابر با 5.29 ppm برای لاروها سمی‌تر بود، در حالی که AITC با 19.35 ppm و 4-HBITC با 55.41 ppm (جدول 4) این سمیت را داشتند. در مقایسه با AITC و BITC، 4-HBITC سمیت کمتری و مقدار LC50 بالاتری دارد. تفاوت‌های قابل توجهی در سمیت لارو پشه دو ایزوتیوسیانات اصلی (Ls و PG) در قوی‌ترین پودر دانه وجود دارد. سمیت بر اساس نسبت دوز کشنده مقادیر LC50 بین AITC، BITC و 4-HBITC تفاوت آماری نشان داد به طوری که فاصله اطمینان 95٪ نسبت دوز کشنده LC50 شامل مقدار 1 نشد (P = 0.05، جدول 4). تخمین زده شد که بالاترین غلظت‌های BITC و AITC، 100٪ لاروهای آزمایش شده را از بین می‌برند (شکل 2).
منحنی‌های مرگ و میر از پاسخ به دوز (Probit) Ae تخمین زده شدند. 24 ساعت پس از درمان، لاروهای مصری (لاروهای سن سوم) به غلظت‌های مصنوعی ایزوتیوسیانات رسیدند. خط چین نشان دهنده LC50 برای درمان ایزوتیوسیانات است. بنزیل ایزوتیوسیانات BITC، آلیل ایزوتیوسیانات AITC و 4-HBITC.
استفاده از آفت‌کش‌های زیستی گیاهی به عنوان عوامل کنترل ناقل پشه مدت‌هاست که مورد مطالعه قرار گرفته است. بسیاری از گیاهان مواد شیمیایی طبیعی تولید می‌کنند که فعالیت حشره‌کشی دارند37. ترکیبات زیست‌فعال آنها جایگزین جذابی برای حشره‌کش‌های مصنوعی با پتانسیل بالا در کنترل آفات، از جمله پشه‌ها، فراهم می‌کنند.
گیاهان خردل به عنوان یک محصول برای دانه‌هایشان کشت می‌شوند، به عنوان ادویه و منبع روغن استفاده می‌شوند. هنگامی که روغن خردل از دانه‌ها استخراج می‌شود یا وقتی خردل برای استفاده به عنوان سوخت زیستی استخراج می‌شود،69 محصول جانبی، پودر دانه بدون چربی است. این پودر دانه بسیاری از اجزای بیوشیمیایی طبیعی و آنزیم‌های هیدرولیتیک خود را حفظ می‌کند. سمیت این پودر دانه به تولید ایزوتیوسیانات‌ها نسبت داده می‌شود55،60،61. ایزوتیوسیانات‌ها با هیدرولیز گلوکوزینولات‌ها توسط آنزیم میروزیناز در طول هیدراتاسیون پودر دانه تشکیل می‌شوند38،55،70 و دارای اثرات قارچ‌کشی، باکتری‌کشی، نماتدکشی و حشره‌کشی و همچنین سایر خواص از جمله اثرات حسی شیمیایی و خواص شیمی‌درمانی61،62،70 هستند. مطالعات متعددی نشان داده‌اند که گیاه خردل و پودر دانه به عنوان فومیگانت در برابر آفات خاک و مواد غذایی انباری به طور مؤثر عمل می‌کنند57،59،71،72. در این مطالعه، ما سمیت پودر چهار دانه و سه محصول زیست فعال آن AITC، BITC و 4-HBITC را برای لارو پشه Aedes ارزیابی کردیم. Aedes aegypti. انتظار می‌رود افزودن پودر دانه به طور مستقیم به آب حاوی لارو پشه، فرآیندهای آنزیمی را فعال کند که ایزوتیوسیانات‌هایی تولید می‌کنند که برای لارو پشه سمی هستند. این تبدیل زیستی تا حدی با فعالیت لاروکشی مشاهده شده پودر دانه و از دست دادن فعالیت حشره‌کشی هنگام عملیات حرارتی پودر دانه خردل کوتوله قبل از استفاده نشان داده شد. انتظار می‌رود عملیات حرارتی آنزیم‌های هیدرولیتیک فعال کننده گلوکوزینولات‌ها را از بین ببرد و در نتیجه از تشکیل ایزوتیوسیانات‌های زیست فعال جلوگیری کند. این اولین مطالعه‌ای است که خواص حشره‌کشی پودر دانه کلم را در برابر پشه‌ها در یک محیط آبی تأیید می‌کند.
در میان پودرهای بذر آزمایش شده، پودر بذر شاهی آبی (Ls) سمی‌ترین بود و باعث مرگ و میر بالای Aedes albopictus شد. لاروهای Aedes aegypti به مدت 24 ساعت به طور مداوم فرآوری شدند. سه پودر بذر باقی مانده (PG، IG و DFP) فعالیت کندتری داشتند و پس از 72 ساعت تیمار مداوم، همچنان باعث مرگ و میر قابل توجهی شدند. فقط پودر بذر Ls حاوی مقادیر قابل توجهی گلوکوزینولات بود، در حالی که PG و DFP حاوی میروزیناز و IG حاوی گلوکوزینولات به عنوان گلوکوزینولات اصلی بود (جدول 1). گلوکوتروپائولین به BITC و سینالبین به 4-HBITC61،62 هیدرولیز می‌شود. نتایج زیست‌سنجی ما نشان می‌دهد که هم پودر بذر Ls و هم BITC مصنوعی برای لارو پشه بسیار سمی هستند. جزء اصلی پودر بذر PG و DFP، گلوکوزینولات میروزیناز است که به AITC هیدرولیز می‌شود. AITC با مقدار LC50 معادل 19.35 ppm در کشتن لارو پشه مؤثر است. در مقایسه با AITC و BITC، ایزوتیوسیانات 4-HBITC کمترین سمیت را برای لاروها دارد. اگرچه AITC سمیت کمتری نسبت به BITC دارد، اما مقادیر LC50 آنها از بسیاری از روغن‌های اساسی آزمایش شده روی لارو پشه کمتر است32،73،74،75.
پودر دانه کلم ما برای استفاده در برابر لارو پشه حاوی یک گلوکوزینولات اصلی است که بیش از 98-99٪ از کل گلوکوزینولات‌های تعیین شده توسط HPLC را تشکیل می‌دهد. مقادیر ناچیزی از سایر گلوکوزینولات‌ها شناسایی شد، اما میزان آنها کمتر از 0.3٪ از کل گلوکوزینولات‌ها بود. پودر دانه شاهی آبی (L. sativum) حاوی گلوکوزینولات‌های ثانویه (سینیگرین) است، اما نسبت آنها 1٪ از کل گلوکوزینولات‌ها است و محتوای آنها هنوز ناچیز است (حدود 0.4 میلی‌گرم در گرم پودر دانه). اگرچه PG و DFP حاوی گلوکوزینولات اصلی یکسانی (میروزین) هستند، فعالیت لاروکشی پودر دانه‌های آنها به دلیل مقادیر LC50 آنها به طور قابل توجهی متفاوت است. از نظر سمیت برای کپک پودری متفاوت است. ظهور لاروهای Aedes aegypti ممکن است به دلیل تفاوت در فعالیت میروزیناز یا پایداری بین دو خوراک دانه باشد. فعالیت میروزیناز نقش مهمی در فراهمی زیستی محصولات هیدرولیز مانند ایزوتیوسیانات‌ها در گیاهان خانواده کلم دارد76. گزارش‌های قبلی توسط پوکوک و همکاران77 و ویلکینسون و همکاران78 نشان داده‌اند که تغییرات در فعالیت و پایداری میروزیناز ممکن است با عوامل ژنتیکی و محیطی نیز مرتبط باشد.
میزان ایزوتیوسیانات زیست‌فعال مورد انتظار بر اساس مقادیر LC50 هر پودر دانه در 24 و 72 ساعت (جدول 5) برای مقایسه با کاربردهای شیمیایی مربوطه محاسبه شد. پس از 24 ساعت، ایزوتیوسیانات‌های موجود در پودر دانه سمی‌تر از ترکیبات خالص بودند. مقادیر LC50 محاسبه شده بر اساس قسمت در میلیون (ppm) تیمارهای بذر ایزوتیوسیانات کمتر از مقادیر LC50 برای کاربردهای BITC، AITC و 4-HBITC بود. ما مشاهده کردیم که لاروها گلوله‌های پودر دانه را مصرف می‌کنند (شکل 3A). در نتیجه، لاروها ممکن است با خوردن گلوله‌های پودر دانه، در معرض ایزوتیوسیانات‌های سمی بیشتری قرار گیرند. این امر در تیمارهای پودر دانه IG و PG در مواجهه 24 ساعته بیشتر مشهود بود، جایی که غلظت LC50 به ترتیب 75٪ و 72٪ کمتر از تیمارهای AITC خالص و 4-HBITC بود. تیمارهای Ls و DFP نسبت به ایزوتیوسیانات خالص سمی‌تر بودند و مقادیر LC50 آنها به ترتیب 24٪ و 41٪ کمتر بود. لاروها در تیمار شاهد با موفقیت شفیره شدند (شکل 3B)، در حالی که بیشتر لاروها در تیمار آرد دانه شفیره نشدند و رشد لارو به طور قابل توجهی به تأخیر افتاد (شکل 3B، D). در Spodopteralitura، ایزوتیوسیانات‌ها با عقب‌ماندگی رشد و تأخیر در رشد مرتبط هستند79.
لاروهای پشه‌های Ae. Aedes aegypti به طور مداوم به مدت 24 تا 72 ساعت در معرض پودر دانه‌های کلم قرار گرفتند. (الف) لاروهای مرده با ذرات پودر دانه در قطعات دهانی (دایره کشیده شده)؛ (ب) تیمار شاهد (dH20 بدون پودر دانه اضافه شده) نشان می‌دهد که لاروها به طور طبیعی رشد می‌کنند و پس از 72 ساعت شروع به شفیره شدن می‌کنند (ج، د) لاروهای تیمار شده با پودر دانه؛ پودر دانه تفاوت‌هایی در رشد نشان داد و شفیره نشد.
ما مکانیسم اثرات سمی ایزوتیوسیانات‌ها را بر روی لارو پشه مطالعه نکرده‌ایم. با این حال، مطالعات قبلی روی مورچه‌های آتشین قرمز (Solenopsis invicta) نشان داده است که مهار گلوتاتیون S-ترانسفراز (GST) و استراز (EST) مکانیسم اصلی فعالیت زیستی ایزوتیوسیانات است و AITC، حتی در فعالیت کم، می‌تواند فعالیت GST را نیز مهار کند. مورچه‌های آتشین قرمز وارداتی در غلظت‌های پایین. دوز 0.5 میکروگرم در میلی‌لیتر80 است. در مقابل، AITC استیل کولین استراز را در شپشه‌های ذرت بالغ (Sitophilus zeamais)81 مهار می‌کند. مطالعات مشابهی باید برای روشن شدن مکانیسم فعالیت ایزوتیوسیانات در لارو پشه انجام شود.
ما از تیمار DFP غیرفعال‌شده با حرارت برای تأیید این پیشنهاد استفاده می‌کنیم که هیدرولیز گلوکوزینولات‌های گیاهی برای تشکیل ایزوتیوسیانات‌های واکنش‌پذیر به عنوان مکانیسمی برای کنترل لارو پشه توسط پودر دانه خردل عمل می‌کند. پودر دانه DFP-HT در میزان‌های مصرفی آزمایش‌شده سمی نبود. لافارگا و همکاران. 82 گزارش دادند که گلوکوزینولات‌ها در دماهای بالا به تخریب حساس هستند. همچنین انتظار می‌رود تیمار حرارتی آنزیم میروزیناز را در پودر دانه دناتوره کند و از هیدرولیز گلوکوزینولات‌ها برای تشکیل ایزوتیوسیانات‌های واکنش‌پذیر جلوگیری کند. این موضوع همچنین توسط اوکوناده و همکاران. 75 تأیید شد. نشان داد که میروزیناز به دما حساس است و نشان می‌دهد که فعالیت میروزیناز هنگامی که دانه‌های خردل، خردل سیاه و ریشه خونی در معرض دمای بالاتر از 80 درجه سانتیگراد قرار می‌گیرند، کاملاً غیرفعال می‌شود. این مکانیسم‌ها ممکن است منجر به از دست رفتن فعالیت حشره‌کشی پودر دانه DFP تیمار شده با حرارت شود.
بنابراین، کنجاله دانه خردل و سه ایزوتیوسیانات اصلی آن برای لارو پشه سمی هستند. با توجه به این تفاوت‌ها بین کنجاله دانه و درمان‌های شیمیایی، استفاده از کنجاله دانه ممکن است یک روش مؤثر برای کنترل پشه باشد. برای بهبود اثربخشی و پایداری استفاده از پودرهای دانه، نیاز به شناسایی فرمولاسیون‌های مناسب و سیستم‌های انتقال مؤثر وجود دارد. نتایج ما نشان دهنده استفاده بالقوه از کنجاله دانه خردل به عنوان جایگزینی برای آفت‌کش‌های مصنوعی است. این فناوری می‌تواند به ابزاری نوآورانه برای کنترل ناقلین پشه تبدیل شود. از آنجا که لارو پشه در محیط‌های آبی رشد می‌کند و گلوکوزینولات‌های کنجاله دانه پس از هیدراتاسیون به صورت آنزیمی به ایزوتیوسیانات‌های فعال تبدیل می‌شوند، استفاده از کنجاله دانه خردل در آب آلوده به پشه، پتانسیل کنترل قابل توجهی را ارائه می‌دهد. اگرچه فعالیت لاروکشی ایزوتیوسیانات‌ها متفاوت است (BITC > AITC > 4-HBITC)، تحقیقات بیشتری برای تعیین اینکه آیا ترکیب کنجاله دانه با چندین گلوکوزینولات به صورت هم‌افزایی سمیت را افزایش می‌دهد یا خیر، مورد نیاز است. این اولین مطالعه‌ای است که اثرات حشره‌کشی پودر دانه کلم بدون چربی و سه ایزوتیوسیانات زیست‌فعال را بر روی پشه‌ها نشان می‌دهد. نتایج این مطالعه با نشان دادن اینکه پودر دانه کلم بدون چربی، یک محصول جانبی استخراج روغن از دانه‌ها، ممکن است به عنوان یک عامل لاروکش امیدوارکننده برای کنترل پشه‌ها عمل کند، زمینه جدیدی را ایجاد می‌کند. این اطلاعات می‌تواند به کشف بیشتر عوامل کنترل زیستی گیاهی و توسعه آنها به عنوان آفت‌کش‌های زیستی ارزان، کاربردی و سازگار با محیط زیست کمک کند.
مجموعه داده‌های تولید شده برای این مطالعه و تجزیه و تحلیل‌های حاصل از آن، بنا به درخواست معقول، از نویسنده مسئول در دسترس است. در پایان مطالعه، تمام مواد مورد استفاده در مطالعه (حشرات و پودر دانه) معدوم شدند.