ترکیبی از ترکیبات ترپنی بر پایه روغن‌های ضروری گیاهی به عنوان یک داروی لاروکش و حشره‌کش بالغ علیه آئدس اجیپتی (دوبالان: کولیسیده)

از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین نتیجه، توصیه می‌کنیم از نسخه جدیدتر مرورگر خود استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل یا جاوا اسکریپت نمایش می‌دهیم.
ترکیبات حشره‌کش مشتق‌شده از گیاهان ممکن است اثرات متقابل هم‌افزایی یا آنتاگونیستی علیه آفات داشته باشند. با توجه به گسترش سریع بیماری‌هایی که توسط پشه‌های آئدس منتقل می‌شوند و افزایش مقاومت جمعیت‌های پشه آئدس در برابر حشره‌کش‌های سنتی، بیست و هشت ترکیب از ترکیبات ترپنی بر پایه روغن‌های ضروری گیاهی فرموله و علیه مراحل لاروی و بالغ آئدس اجیپتی آزمایش شدند. در ابتدا پنج روغن ضروری گیاهی (EOs) از نظر اثربخشی لاروکشی و استفاده در بزرگسالان ارزیابی شدند و بر اساس نتایج GC-MS، دو ترکیب اصلی در هر EO شناسایی شدند. ترکیبات اصلی شناسایی‌شده، یعنی دی‌آلیل دی‌سولفید، دی‌آلیل تری‌سولفید، کاروون، لیمونن، اوژنول، متیل اوژنول، اوکالیپتول، اودسمول و آلفا-پینن پشه، خریداری شدند. سپس ترکیبات دوتایی این ترکیبات با استفاده از دوزهای زیرکشنده تهیه شدند و اثرات هم‌افزایی و آنتاگونیستی آنها آزمایش و تعیین شد. بهترین ترکیبات لاروکش با مخلوط کردن لیمونن با دی‌آلیل دی‌سولفید و بهترین ترکیبات بزرگسالان‌کش با مخلوط کردن کاروون با لیمونن به دست می‌آیند. لاروکش مصنوعی تجاری تمفوس و داروی بزرگسالان مالاتیون به طور جداگانه و در ترکیبات دوتایی با ترپنوئیدها آزمایش شدند. نتایج نشان داد که ترکیب تمفوس و دی‌آلیل دی‌سولفید و مالاتیون و اودسمول مؤثرترین ترکیب بود. این ترکیبات قوی پتانسیل استفاده علیه آئدس اجیپتی را دارند.
روغن‌های ضروری گیاهی (EOs) متابولیت‌های ثانویه حاوی ترکیبات فعال زیستی مختلف هستند و به عنوان جایگزینی برای آفت‌کش‌های مصنوعی اهمیت فزاینده‌ای پیدا می‌کنند. آن‌ها نه تنها سازگار با محیط زیست و کاربرپسند هستند، بلکه ترکیبی از ترکیبات فعال زیستی مختلف نیز می‌باشند که احتمال ایجاد مقاومت دارویی را نیز کاهش می‌دهند1. محققان با استفاده از فناوری GC-MS، ترکیبات روغن‌های ضروری گیاهی مختلف را بررسی کرده و بیش از 3000 ترکیب از 17500 گیاه معطر2 را شناسایی کردند که اکثر آن‌ها از نظر خواص حشره‌کشی آزمایش شده‌اند و گزارش شده است که اثرات حشره‌کشی دارند3،4. برخی مطالعات نشان می‌دهند که سمیت جزء اصلی این ترکیب برابر یا بیشتر از اکسید اتیلن خام آن است. اما استفاده از ترکیبات منفرد ممکن است دوباره جایی برای ایجاد مقاومت باقی بگذارد، همانطور که در مورد حشره‌کش‌های شیمیایی5،6 وجود دارد. بنابراین، تمرکز فعلی بر تهیه مخلوط‌هایی از ترکیبات مبتنی بر اکسید اتیلن برای بهبود اثربخشی حشره‌کشی و کاهش احتمال مقاومت در جمعیت آفات هدف است. ترکیبات فعال منفرد موجود در اسانس‌ها (EOs) ممکن است اثرات هم‌افزایی یا آنتاگونیستی در ترکیبات نشان دهند که منعکس‌کننده فعالیت کلی اسانس است، واقعیتی که در مطالعات انجام شده توسط محققان قبلی به خوبی مورد تأکید قرار گرفته است7،8. برنامه کنترل ناقلین همچنین شامل اسانس‌ها و اجزای آن است. فعالیت پشه‌کشی روغن‌های اساسی به طور گسترده روی پشه‌های کولکس و آنوفل مورد مطالعه قرار گرفته است. مطالعات متعددی تلاش کرده‌اند تا با ترکیب گیاهان مختلف با آفت‌کش‌های مصنوعی تجاری، آفت‌کش‌های مؤثری را برای افزایش سمیت کلی و به حداقل رساندن عوارض جانبی توسعه دهند9. اما مطالعات چنین ترکیباتی علیه آئدس ... در شرایط فعلی، کنترل پشه آئدس آئجیپتی بسیار مهم است زیرا ناقل کلیدی ویروس‌های مختلف و سروتیپ‌های آنها است که باعث تب دنگی، زیکا، تب خونریزی دهنده دنگی، تب زرد و غیره می‌شوند. نکته قابل توجه این واقعیت است که تعداد موارد تقریباً همه بیماری‌های ناشی از پشه آئدس که از طریق ناقل منتقل می‌شوند، هر ساله در مصر و در سراسر جهان در حال افزایش است. بنابراین، در این زمینه، نیاز مبرمی به توسعه اقدامات کنترلی سازگار با محیط زیست و مؤثر برای جمعیت‌های پشه آئدس آئجیپتی وجود دارد. کاندیداهای بالقوه در این زمینه، اسانس‌ها، ترکیبات تشکیل دهنده آنها و ترکیبات آنها هستند. بنابراین، این مطالعه تلاش کرد تا ترکیبات هم‌افزایی مؤثر از ترکیبات اسانس‌های گیاهی کلیدی را از پنج گیاه با خواص حشره‌کشی (یعنی نعناع، ​​ریحان مقدس، اکالیپتوس خالدار، سیر و ملالوکا) علیه آئدس آئجیپتی شناسایی کند.
تمام اسانس‌های انتخاب‌شده فعالیت لاروکشی بالقوه‌ای علیه Aedes aegypti با LC50 24 ساعته از 0.42 تا 163.65 ppm نشان دادند. بالاترین فعالیت لاروکشی برای اسانس نعناع فلفلی (Mp) با مقدار LC50 0.42 ppm در 24 ساعت و پس از آن سیر (As) با مقدار LC50 16.19 ppm در 24 ساعت ثبت شد (جدول 1).
به استثنای Ocimum Sainttum و Os EO، هر چهار اسانس غربالگری شده دیگر اثرات آلرژی‌زایی آشکاری نشان دادند، به طوری که مقادیر LC50 آنها در طول دوره مواجهه 24 ساعته از 23.37 تا 120.16 ppm متغیر بود. اسانس Thymophilus striata (Cl) با مقدار LC50 معادل 23.37 ppm در 24 ساعت پس از مواجهه، بیشترین تأثیر را در کشتن بزرگسالان داشت و پس از آن Eucalyptus maculata (Em) با مقدار LC50 معادل 101.91 ppm قرار داشت (جدول 1). از سوی دیگر، مقدار LC50 برای Os هنوز مشخص نشده است زیرا بالاترین میزان مرگ و میر 53٪ در بالاترین دوز ثبت شده است (شکل تکمیلی 3).
دو ترکیب اصلی تشکیل دهنده در هر EO بر اساس نتایج پایگاه داده کتابخانه NIST، درصد مساحت کروماتوگرام GC و نتایج طیف‌های MS شناسایی و انتخاب شدند (جدول 2). برای EO As، ترکیبات اصلی شناسایی شده دی‌آلیل دی‌سولفید و دی‌آلیل تری‌سولفید بودند؛ برای EO Mp ترکیبات اصلی شناسایی شده کارون و لیمونن بودند، برای EO Em ترکیبات اصلی شناسایی شده اودسمول و اوکالیپتول بودند؛ برای EO Os ترکیبات اصلی شناسایی شده اوژنول و متیل اوژنول بودند و برای EO Cl ترکیبات اصلی شناسایی شده اوژنول و α-پینن بودند (شکل 1، شکل‌های تکمیلی 5-8، جدول تکمیلی 1-5).
نتایج طیف‌سنجی جرمی ترپنوئیدهای اصلی روغن‌های فرار منتخب (A-دی‌آلیل دی‌سولفید؛ B-دی‌آلیل تری‌سولفید؛ C-اوژنول؛ D-متیل اوژنول؛ E-لیمونن؛ F-آروماتیک سپرون؛ G-α-پینن؛ H-سینئول؛ R-یودامول).
در مجموع نه ترکیب (دی‌آلیل دی‌سولفید، دی‌آلیل تری‌سولفید، اوژنول، متیل اوژنول، کاروون، لیمونن، اوکالیپتول، اودسمول، α-پینن) به عنوان ترکیبات مؤثر که اجزای اصلی EO هستند شناسایی شدند و به صورت جداگانه علیه Aedes aegypti در مراحل لاروی مورد سنجش زیستی قرار گرفتند. ترکیب اودسمول با مقدار LC50 معادل 2.25 ppm پس از 24 ساعت قرار گرفتن در معرض، بالاترین فعالیت لاروکشی را داشت. ترکیبات دی‌آلیل دی‌سولفید و دی‌آلیل تری‌سولفید نیز دارای اثرات لاروکشی بالقوه هستند، با میانگین دوزهای زیرکشنده در محدوده 10 تا 20 ppm. فعالیت لاروکشی متوسط ​​​​برای ترکیبات اوژنول، لیمونن و اوکالیپتول با مقادیر LC50 معادل 63.35 ppm و 139.29 ppm دوباره مشاهده شد. و به ترتیب ۱۸۱.۳۳ ppm پس از ۲۴ ساعت (جدول ۳). با این حال، هیچ پتانسیل لاروکشی قابل توجهی از متیل اوژنول و کاروون حتی در بالاترین دوزها مشاهده نشد، بنابراین مقادیر LC50 محاسبه نشدند (جدول ۳). لاروکش مصنوعی تمفوس (Temephos) در طول ۲۴ ساعت مواجهه، غلظت کشنده متوسط ​​۰.۴۳ ppm علیه آئدس اجیپتی (Aedes aegypti) داشت (جدول ۳، جدول تکمیلی ۶).
هفت ترکیب (دی‌آلیل دی‌سولفید، دی‌آلیل تری‌سولفید، اوکالیپتول، آلفا-پینن، اودسمول، لیمونن و کاروون) به عنوان ترکیبات اصلی EO مؤثر شناسایی شدند و به صورت جداگانه علیه پشه‌های بالغ آئدس مصری آزمایش شدند. طبق تجزیه و تحلیل رگرسیون پروبیت، مشخص شد که اودسمول با مقدار LC50 برابر با 1.82 ppm بالاترین پتانسیل را دارد و پس از آن اوکالیپتول با مقدار LC50 برابر با 17.60 ppm در زمان قرار گرفتن در معرض 24 ساعته قرار دارد. پنج ترکیب باقیمانده آزمایش شده برای بزرگسالان با LC50 از 140.79 تا 737.01 ppm نسبتاً مضر بودند (جدول 3). مالاتیون ارگانوفسفر مصنوعی با مقدار LC50 برابر با 5.44 ppm در طول دوره قرار گرفتن در معرض 24 ساعته، قدرت کمتری نسبت به اودسمول و بالاتر از شش ترکیب دیگر بود (جدول 3، جدول تکمیلی 6).
هفت ترکیب قوی سرب و تامفوسات ارگانوفسفره برای فرموله کردن ترکیبات دوتایی از دوزهای LC50 آنها با نسبت 1:1 انتخاب شدند. در مجموع 28 ترکیب دوتایی تهیه و برای بررسی اثربخشی لاروکشی آنها در برابر Aedes aegypti آزمایش شدند. مشخص شد که نه ترکیب اثر سینرژیک، 14 ترکیب اثر آنتاگونیستی و پنج ترکیب اثر لاروکشی نداشتند. در میان ترکیبات سینرژیک، ترکیب دی‌آلیل دی‌سولفید و تموفول موثرترین بود، با 100٪ مرگ و میر مشاهده شده پس از 24 ساعت (جدول 4). به طور مشابه، مخلوط‌های لیمونن با دی‌آلیل دی‌سولفید و اوژنول با تیمتفوس پتانسیل خوبی با مرگ و میر مشاهده شده 98.3٪ در لاروها نشان دادند (جدول 5). 4 ترکیب باقی‌مانده، یعنی اودسمول به علاوه اکالیپتول، اودسمول به علاوه لیمونن، اوکالیپتول به علاوه آلفا-پینن، آلفا-پینن به علاوه تمفوس، نیز اثربخشی لاروکشی قابل توجهی نشان دادند، با میزان مرگ و میر مشاهده شده بیش از 90٪. میزان مرگ و میر مورد انتظار نزدیک به 60-75٪ است. (جدول 4). با این حال، ترکیب لیمونن با آلفا-پینن یا اکالیپتوس واکنش‌های آنتاگونیستی نشان داد. به همین ترتیب، مشخص شده است که مخلوط‌های تمفوس با اوژنول یا اکالیپتوس یا اودسمول یا دی‌آلیل تری‌سولفید اثرات آنتاگونیستی دارند. به همین ترتیب، ترکیب دی‌آلیل دی‌سولفید و دی‌آلیل تری‌سولفید و ترکیب هر یک از این ترکیبات با اودسمول یا اوژنول در عمل لاروکشی خود آنتاگونیستی هستند. همچنین اثر آنتاگونیستی با ترکیب اودسمول با اوژنول یا α-پینن گزارش شده است.
از بین تمام 28 مخلوط دوتایی که برای فعالیت اسیدی بالغین آزمایش شدند، 7 ترکیب اثر سینرژیک داشتند، 6 ترکیب هیچ اثری نداشتند و 15 ترکیب اثر آنتاگونیستی داشتند. مخلوط‌های اودسمول با اکالیپتوس و لیمونن با کارون، با میزان مرگ و میر 76٪ و 100٪ در 24 ساعت، مؤثرتر از سایر ترکیبات سینرژیک بودند (جدول 5). مشاهده شده است که مالاتیون با تمام ترکیبات به جز لیمونن و دی‌آلیل تری‌سولفید، اثر سینرژیک نشان می‌دهد. از سوی دیگر، اثر آنتاگونیستی بین دی‌آلیل دی‌سولفید و دی‌آلیل تری‌سولفید و ترکیب هر یک از آنها با اکالیپتوس، یا اکالیپتول، یا کارون، یا لیمونن مشاهده شده است. به طور مشابه، ترکیبات α-پینن با اودسمول یا لیمونن، اکالیپتول با کاروون یا لیمونن، و لیمونن با اودسمول یا مالاتیون اثرات لاروکشی آنتاگونیستی نشان دادند. برای شش ترکیب باقی مانده، تفاوت معنی داری بین مرگ و میر مورد انتظار و مشاهده شده وجود نداشت (جدول 5).
بر اساس اثرات سینرژیک و دوزهای زیرکشنده، سمیت لاروکشی آنها در برابر تعداد زیادی از پشه‌های Aedes aegypti در نهایت انتخاب و آزمایش‌های بیشتری انجام شد. نتایج نشان داد که مرگ و میر لارو مشاهده شده با استفاده از ترکیبات دوتایی اوژنول-لیمونن، دی‌آلیل دی‌سولفید-لیمونن و دی‌آلیل دی‌سولفید-تیمفوس ۱۰۰٪ بود، در حالی که مرگ و میر لارو مورد انتظار به ترتیب ۷۶.۴۸٪، ۷۲.۱۶٪ و ۶۳.۴٪ بود (جدول ۶). ترکیب لیمونن و اودسمول نسبتاً کمتر مؤثر بود، به طوری که ۸۸٪ مرگ و میر لارو در دوره مواجهه ۲۴ ساعته مشاهده شد (جدول ۶). به طور خلاصه، چهار ترکیب دوتایی انتخاب شده همچنین اثرات لاروکشی سینرژیک را در برابر Aedes aegypti در صورت استفاده در مقیاس بزرگ نشان دادند (جدول ۶).
سه ترکیب سینرژیک برای سنجش زیستی کشنده حشرات بالغ جهت کنترل جمعیت‌های بزرگ پشه‌های آئدس اجیپتی بالغ انتخاب شدند. برای انتخاب ترکیبات جهت آزمایش روی کلنی‌های بزرگ حشرات، ابتدا بر روی دو ترکیب ترپن سینرژیک برتر، یعنی کارون به همراه لیمونن و اکالیپتول به همراه اودسمول تمرکز کردیم. در مرحله دوم، بهترین ترکیب سینرژیک از ترکیب مالاتیون ارگانوفسفره مصنوعی و ترپنوئیدها انتخاب شد. ما معتقدیم که ترکیب مالاتیون و اودسمول به دلیل بالاترین میزان مرگ و میر مشاهده شده و مقادیر بسیار پایین LC50 ترکیبات کاندید، بهترین ترکیب برای آزمایش روی کلنی‌های بزرگ حشرات است. مالاتیون در ترکیب با α-پینن، دی‌آلیل دی‌سولفید، اکالیپتوس، کارون و اودسمول، سینرژیک نشان می‌دهد. اما اگر به مقادیر LC50 نگاه کنیم، اودسمول کمترین مقدار (2.25 ppm) را دارد. مقادیر LC50 محاسبه‌شده برای مالاتیون، آلفا-پینن، دی‌آلیل دی‌سولفید، اکالیپتول و کاروون به ترتیب 5.4، 716.55، 166.02، 17.6 و 140.79 ppm بود. این مقادیر نشان می‌دهد که ترکیب مالاتیون و اودسمول از نظر دوز، ترکیب بهینه است. نتایج نشان داد که ترکیبات کاروون به همراه لیمونن و اودسمول به همراه مالاتیون، 100٪ مرگ و میر مشاهده‌شده در مقایسه با مرگ و میر مورد انتظار 61٪ تا 65٪ داشتند. ترکیب دیگری، اودسمول به همراه اوکالیپتول، پس از 24 ساعت مواجهه، میزان مرگ و میر 78.66٪ را نشان داد، در حالی که میزان مرگ و میر مورد انتظار 60٪ بود. هر سه ترکیب انتخاب‌شده حتی زمانی که در مقیاس وسیع علیه پشه‌های بالغ آئدس اجیپتی اعمال شدند، اثرات هم‌افزایی نشان دادند (جدول 6).
در این مطالعه، اسانس‌های گیاهی منتخب مانند Mp، As، Os، Em و Cl اثرات کشنده امیدوارکننده‌ای بر مراحل لاروی و بالغ Aedes aegypti نشان دادند. اسانس Mp با مقدار LC50 برابر با 0.42 ppm بالاترین فعالیت لاروکشی را داشت و پس از آن اسانس‌های As، Os و Em با مقدار LC50 کمتر از 50 ppm پس از 24 ساعت قرار داشتند. این نتایج با مطالعات قبلی روی پشه‌ها و سایر مگس‌های دوبالان مطابقت دارد10،11،12،13،14. اگرچه قدرت لاروکشی اسانس Cl با مقدار LC50 برابر با 163.65 ppm پس از 24 ساعت کمتر از سایر اسانس‌های ضروری است، اما پتانسیل لاروکشی آن با مقدار LC50 برابر با 23.37 ppm پس از 24 ساعت بالاترین است. اسانس‌های Mp، As و Em نیز پتانسیل آلرژی‌زایی خوبی با مقادیر LC50 در محدوده 100 تا 120 ppm در 24 ساعت پس از مواجهه نشان دادند، اما این مقدار نسبتاً کمتر از اثربخشی لاروکشی آنها بود. از سوی دیگر، اسانس Os حتی در بالاترین دوز درمانی نیز اثر آلرژی‌زایی ناچیزی نشان داد. بنابراین، نتایج نشان می‌دهد که سمیت اتیلن اکسید برای گیاهان ممکن است بسته به مرحله رشدی پشه‌ها متفاوت باشد15. همچنین به میزان نفوذ اسانس‌ها به بدن حشره، تعامل آنها با آنزیم‌های هدف خاص و ظرفیت سم‌زدایی پشه در هر مرحله رشدی بستگی دارد16. تعداد زیادی از مطالعات نشان داده‌اند که ترکیب جزء اصلی، عامل مهمی در فعالیت بیولوژیکی اتیلن اکسید است، زیرا اکثر ترکیبات کل را تشکیل می‌دهد3،12،17،18. بنابراین، ما دو ترکیب اصلی را در هر اسانس در نظر گرفتیم. بر اساس نتایج GC-MS، دی‌آلیل دی‌سولفید و دی‌آلیل تری‌سولفید به عنوان ترکیبات اصلی EO As شناسایی شدند که با گزارش‌های قبلی مطابقت دارد19،20،21. اگرچه گزارش‌های قبلی نشان می‌دادند که منتول یکی از ترکیبات اصلی آن است، کاروون و لیمونن دوباره به عنوان ترکیبات اصلی Mp EO شناسایی شدند22،23. مشخصات ترکیب Os EO نشان داد که اوژنول و متیل اوژنول ترکیبات اصلی هستند که مشابه یافته‌های محققان قبلی است16،24. اکالیپتول و اوکالیپتول به عنوان ترکیبات اصلی موجود در روغن برگ Em گزارش شده‌اند که با یافته‌های برخی از محققان مطابقت دارد25،26 اما برخلاف یافته‌های Olalade و همکاران27. غالبیت سینئول و α-پینن در روغن اسانس melaleuca مشاهده شد که مشابه مطالعات قبلی است28،29. تفاوت‌های درون گونه‌ای در ترکیب و غلظت روغن‌های ضروری استخراج شده از گونه‌های گیاهی مشابه در مکان‌های مختلف گزارش شده و در این مطالعه نیز مشاهده شد که تحت تأثیر شرایط جغرافیایی رشد گیاه، زمان برداشت، مرحله رشد یا سن گیاه، ظاهر کموتیپ‌ها و غیره قرار دارند.22،30،31،32. سپس ترکیبات کلیدی شناسایی شده خریداری و از نظر اثرات لاروکشی و اثرات آنها بر پشه‌های بالغ Aedes aegypti آزمایش شدند. نتایج نشان داد که فعالیت لاروکشی دی‌آلیل دی‌سولفید با EO As خام قابل مقایسه است. اما فعالیت دی‌آلیل تری‌سولفید بیشتر از EO As است. این نتایج مشابه نتایج به دست آمده توسط Kimbaris و همکاران. 33 روی Culex philippines است. با این حال، این دو ترکیب فعالیت خودکششی خوبی در برابر پشه‌های هدف نشان ندادند، که با نتایج Plata-Rueda و همکاران. 34 روی Tenebrio molitor مطابقت دارد. اسانس اوژنول (Os EO) علیه مرحله لاروی پشه آئدس اجیپتی (Aedes aegypti) مؤثر است، اما علیه مرحله بالغ آن مؤثر نیست. مشخص شده است که فعالیت لاروکشی ترکیبات اصلی منفرد کمتر از اسانس اوژنول خام است. این امر نشان‌دهنده نقش سایر ترکیبات و برهمکنش‌های آنها در اکسید اتیلن خام است. متیل اوژنول به تنهایی فعالیت ناچیزی دارد، در حالی که اوژنول به تنهایی فعالیت لاروکشی متوسطی دارد. این نتیجه‌گیری از یک سو، 35،36 را تأیید می‌کند و از سوی دیگر، با نتیجه‌گیری‌های محققان قبلی 37،38 در تضاد است. تفاوت در گروه‌های عاملی اوژنول و متیل اوژنول ممکن است منجر به سمیت‌های مختلف برای یک حشره هدف شود 39. مشخص شد که لیمونن فعالیت لاروکشی متوسطی دارد، در حالی که اثر کاروون ناچیز بود. به طور مشابه، سمیت نسبتاً کم لیمونن برای حشرات بالغ و سمیت بالای کاروون، نتایج برخی از مطالعات قبلی 40 را تأیید می‌کند اما با سایر مطالعات 41 در تضاد است. وجود پیوندهای دوگانه در هر دو موقعیت درون حلقه‌ای و برون حلقه‌ای ممکن است مزایای این ترکیبات را به عنوان لاروکش افزایش دهد3،41، در حالی که کاروون، که یک کتون با کربن‌های آلفا و بتای غیراشباع است، ممکن است پتانسیل بالاتری برای سمیت در بزرگسالان نشان دهد42. با این حال، ویژگی‌های فردی لیمونن و کاروون بسیار کمتر از کل EO Mp است (جدول 1، جدول 3). در میان ترپنوئیدهای آزمایش شده، مشخص شد که اودسمول با مقدار LC50 کمتر از 2.5 ppm بیشترین فعالیت لاروکشی و بالغ را دارد و آن را به یک ترکیب امیدوارکننده برای کنترل پشه‌های Aedes تبدیل می‌کند. عملکرد آن از کل EO Em بهتر است، اگرچه این با یافته‌های چنگ و همکاران 40 مطابقت ندارد. اودسمول یک سسکوئی‌ترپن با دو واحد ایزوپرن است که نسبت به مونوترپن‌های اکسیژن‌دار مانند اکالیپتوس فراریت کمتری دارد و بنابراین پتانسیل بیشتری به عنوان آفت‌کش دارد. خود اکالیپتول فعالیت حشره‌کشی بیشتری نسبت به لاروکشی دارد و نتایج مطالعات قبلی هم این موضوع را تأیید و هم رد می‌کند37،43،44. این فعالیت به تنهایی تقریباً با کل EO Cl قابل مقایسه است. یکی دیگر از مونوترپن‌های دو حلقه‌ای، α-پینن، اثر کمتری نسبت به لاروکشی روی Aedes aegypti دارد که برعکس اثر EO Cl کامل است. فعالیت حشره‌کشی کلی ترپنوئیدها تحت تأثیر لیپوفیلی بودن، فراریت، شاخه‌بندی کربن، مساحت برآمدگی، مساحت سطح، گروه‌های عاملی و موقعیت‌های آنها قرار دارد45،46. این ترکیبات ممکن است با از بین بردن تجمعات سلولی، مسدود کردن فعالیت تنفسی، قطع انتقال تکانه‌های عصبی و غیره عمل کنند47. مشخص شد که ارگانوفسفات مصنوعی Temephos با مقدار LC50 برابر با 0.43 ppm بالاترین فعالیت لاروکشی را دارد که با داده‌های Lek -Utala48 مطابقت دارد. فعالیت مالاتیون ارگانوفسفره مصنوعی در بزرگسالان 5.44 ppm گزارش شده است. اگرچه این دو ارگانوفسفره پاسخ‌های مطلوبی در برابر سویه‌های آزمایشگاهی Aedes aegypti نشان داده‌اند، اما مقاومت پشه‌ها در برابر این ترکیبات در نقاط مختلف جهان گزارش شده است49. با این حال، هیچ گزارش مشابهی از ایجاد مقاومت در برابر داروهای گیاهی یافت نشده است50. بنابراین، گیاهان دارویی به عنوان جایگزین‌های بالقوه برای آفت‌کش‌های شیمیایی در برنامه‌های کنترل ناقل در نظر گرفته می‌شوند.
اثر لاروکشی بر روی 28 ترکیب دوتایی (1:1) تهیه شده از ترپنوئیدهای قوی و ترپنوئیدها با تیمتفوس آزمایش شد و 9 ترکیب اثر سینرژیک، 14 ترکیب اثر آنتاگونیستی و 5 ترکیب اثر آنتاگونیستی داشتند. هیچ اثری مشاهده نشد. از سوی دیگر، در زیست‌سنجی قدرت در حشرات بالغ، 7 ترکیب اثر سینرژیک، 15 ترکیب اثر آنتاگونیستی و 6 ترکیب اثر بی‌اثری گزارش شد. دلیل اینکه ترکیبات خاص اثر سینرژیک ایجاد می‌کنند، ممکن است به دلیل تعامل همزمان ترکیبات کاندید در مسیرهای مهم مختلف یا مهار متوالی آنزیم‌های کلیدی مختلف یک مسیر بیولوژیکی خاص باشد51. ترکیب لیمونن با دی‌آلیل دی‌سولفید، اکالیپتوس یا اوژنول در کاربردهای کوچک و بزرگ اثر سینرژیک داشت (جدول 6)، در حالی که ترکیب آن با اکالیپتوس یا α-پینن اثرات آنتاگونیستی بر لاروها داشت. به طور متوسط، به نظر می‌رسد لیمونن یک هم افزایی خوب است، احتمالاً به دلیل وجود گروه‌های متیل، نفوذ خوب به لایه شاخی و مکانیسم عمل متفاوت52،53. قبلاً گزارش شده است که لیمونن ممکن است با نفوذ به کوتیکول حشرات (سمیت تماسی)، تأثیر بر سیستم گوارش (ضد تغذیه) یا تأثیر بر سیستم تنفسی (فعالیت بخور) اثرات سمی ایجاد کند54، در حالی که فنیل پروپانوئیدها مانند اوژنول ممکن است بر آنزیم‌های متابولیک تأثیر بگذارند55. بنابراین، ترکیب ترکیبات با مکانیسم‌های عمل متفاوت ممکن است اثر کشنده کلی مخلوط را افزایش دهد. مشخص شد که اکالیپتول با دی آلیل دی سولفید، اکالیپتوس یا α-پینن اثر هم افزایی دارد، اما سایر ترکیبات با سایر ترکیبات یا غیر لاروکش یا آنتاگونیست بودند. مطالعات اولیه نشان داد که اکالیپتول فعالیت مهاری بر استیل کولین استراز (AChE) و همچنین گیرنده‌های اکتامین و GABA دارد56. از آنجایی که مونوترپن‌های حلقوی، اکالیپتول، اوژنول و غیره ممکن است مکانیسم عمل مشابهی با فعالیت نوروتوکسیک خود داشته باشند،57 در نتیجه اثرات ترکیبی آنها را از طریق مهار متقابل به حداقل می‌رسانند. به همین ترتیب، ترکیب تمفوس با دی‌آلیل دی‌سولفید، آلفا-پینن و لیمونن اثر هم‌افزایی داشت که گزارش‌های قبلی مبنی بر اثر هم‌افزایی بین محصولات گیاهی و ارگانوفسفات‌های مصنوعی را تأیید می‌کند58.
مشخص شد که ترکیب اودسمول و اوکالیپتول اثر سینرژیک بر مراحل لاروی و بالغ آئدس اجیپتی دارد، احتمالاً به دلیل نحوه عملکرد متفاوت آنها به دلیل ساختارهای شیمیایی متفاوتشان. اودسمول (یک سسکوئی‌ترپن) ممکن است بر سیستم تنفسی تأثیر بگذارد59 و اوکالیپتول (یک مونوترپن) ممکن است بر استیل کولین استراز تأثیر بگذارد60. قرار گرفتن همزمان این ترکیبات در معرض دو یا چند محل هدف ممکن است اثر کشنده کلی ترکیب را افزایش دهد. در زیست‌سنجی‌های ماده بالغ، مشخص شد که مالاتیون با کارون یا اوکالیپتول یا اوکالیپتول یا دی‌آلیل دی‌سولفید یا α-پینن اثر سینرژیک دارد، که نشان می‌دهد با افزودن لیمونن و دی‌آلیل دی‌سولفید اثر سینرژیک دارد. کاندیداهای آلرسید سینرژیک خوبی برای کل مجموعه ترکیبات ترپن، به استثنای آلیل تری‌سولفید، وجود دارند. Thangam و Kathiresan61 نیز نتایج مشابهی از اثر هم‌افزایی مالاتیون با عصاره‌های گیاهی گزارش کردند. این پاسخ هم‌افزایی ممکن است به دلیل اثرات سمی ترکیبی مالاتیون و مواد شیمیایی گیاهی بر آنزیم‌های سم‌زدای حشرات باشد. ارگانوفسفات‌هایی مانند مالاتیون عموماً با مهار استرازهای سیتوکروم P450 و مونواکسیژنازها عمل می‌کنند62،63،64. بنابراین، ترکیب مالاتیون با این مکانیسم‌های عمل و ترپن‌ها با مکانیسم‌های عمل متفاوت ممکن است اثر کلی کشنده بر روی پشه‌ها را افزایش دهد.
از سوی دیگر، آنتاگونیسم نشان می‌دهد که ترکیبات انتخاب‌شده در ترکیب با یکدیگر، فعالیت کمتری نسبت به هر ترکیب به تنهایی دارند. دلیل آنتاگونیسم در برخی ترکیبات ممکن است این باشد که یک ترکیب با تغییر سرعت جذب، توزیع، متابولیسم یا دفع، رفتار ترکیب دیگر را تغییر می‌دهد. محققان اولیه این را علت آنتاگونیسم در ترکیبات دارویی می‌دانستند. مولکول‌ها مکانیسم احتمالی ۶۵. به طور مشابه، علل احتمالی آنتاگونیسم ممکن است مربوط به مکانیسم‌های مشابه عمل، رقابت ترکیبات تشکیل‌دهنده برای همان گیرنده یا محل هدف باشد. در برخی موارد، مهار غیررقابتی پروتئین هدف نیز ممکن است رخ دهد. در این مطالعه، دو ترکیب ارگانوسولفور، دی‌آلیل دی‌سولفید و دی‌آلیل تری‌سولفید، اثرات آنتاگونیستی نشان دادند، احتمالاً به دلیل رقابت برای همان محل هدف. به همین ترتیب، این دو ترکیب گوگردی اثرات آنتاگونیستی نشان دادند و در ترکیب با اودسمول و α-پینن هیچ تاثیری نداشتند. اودسمول و آلفا-پینن ماهیت حلقوی دارند، در حالی که دی‌آلیل دی‌سولفید و دی‌آلیل تری‌سولفید ماهیت آلیفاتیک دارند. بر اساس ساختار شیمیایی، ترکیب این ترکیبات باید فعالیت کلی کشنده را افزایش دهد زیرا محل‌های هدف آنها معمولاً متفاوت است34،47، اما به صورت تجربی، آنتاگونیسم را یافتیم که ممکن است به دلیل نقش این ترکیبات در برخی از ارگانیسم‌های ناشناخته در داخل بدن باشد. سیستم‌ها در نتیجه تعامل. به طور مشابه، ترکیب سینئول و α-پینن پاسخ‌های آنتاگونیستی ایجاد کرد، اگرچه محققان قبلاً گزارش داده بودند که این دو ترکیب اهداف عمل متفاوتی دارند47،60. از آنجایی که هر دو ترکیب مونوترپن‌های حلقوی هستند، ممکن است برخی از محل‌های هدف مشترک وجود داشته باشند که ممکن است برای اتصال رقابت کنند و بر سمیت کلی جفت‌های ترکیبی مورد مطالعه تأثیر بگذارند.
بر اساس مقادیر LC50 و میزان مرگ و میر مشاهده شده، دو ترکیب ترپن سینرژیک برتر، یعنی جفت‌های کاروون + لیمونن و اکالیپتول + اودسمول، و همچنین مالاتیون ارگانوفسفره مصنوعی با ترپن‌ها انتخاب شدند. ترکیب سینرژیک بهینه ترکیبات مالاتیون + اودسمول در یک سنجش زیستی حشره‌کش بزرگسالان آزمایش شد. برای تأیید اینکه آیا این ترکیبات مؤثر می‌توانند در برابر تعداد زیادی از افراد در فضاهای در معرض قرار گرفتن نسبتاً بزرگ عمل کنند، کلنی‌های حشرات بزرگ را هدف قرار دهید. همه این ترکیبات اثر سینرژیک را در برابر دسته‌های بزرگ حشرات نشان می‌دهند. نتایج مشابهی برای یک ترکیب لاروکش سینرژیک بهینه که در برابر جمعیت‌های زیادی از لاروهای Aedes aegypti آزمایش شد، به دست آمد. بنابراین، می‌توان گفت که ترکیب لاروکش سینرژیک و بالغ‌کش مؤثر ترکیبات EO گیاهی، کاندیدای قوی در برابر مواد شیمیایی مصنوعی موجود است و می‌تواند بیشتر برای کنترل جمعیت‌های Aedes aegypti مورد استفاده قرار گیرد. به همین ترتیب، ترکیبات مؤثر لاروکش‌های مصنوعی یا بزرگسالان‌کش‌ها با ترپن‌ها نیز می‌توانند برای کاهش دوزهای تیمتفوس یا مالاتیون تجویز شده به پشه‌ها استفاده شوند. این ترکیبات هم‌افزایی قوی ممکن است راه‌حل‌هایی برای مطالعات آینده در مورد تکامل مقاومت دارویی در پشه‌های آئدس ارائه دهند.
تخم‌های پشه آئدس اجیپتی از مرکز تحقیقات پزشکی منطقه‌ای، دیبروگار، شورای تحقیقات پزشکی هند جمع‌آوری و در دمای کنترل‌شده (1 ± 28 درجه سانتیگراد) و رطوبت (5 ± 85٪) در بخش جانورشناسی دانشگاه گواهاتی تحت شرایط زیر نگهداری شدند: آریولی و همکاران شرح داده شدند. پس از تفریخ، لاروها با غذای لاروی (پودر بیسکویت سگ و مخمر به نسبت 3:1) و بالغ‌ها با محلول گلوکز 10٪ تغذیه شدند. از روز سوم پس از ظهور، به پشه‌های ماده بالغ اجازه داده شد تا خون موش‌های آلبینو را بمکند. کاغذ صافی را در آب داخل یک لیوان خیس کنید و آن را در قفس تخم‌گذاری قرار دهید.
نمونه‌های گیاهی انتخاب‌شده شامل برگ‌های اکالیپتوس (Myrtaceae)، ریحان مقدس (Lamiaceae)، نعناع (Lamiaceae)، ملالوکا (Myrtaceae) و پیازهای آلیوم (Amaryllidaceae). از گواهاتی جمع‌آوری و توسط بخش گیاه‌شناسی دانشگاه گواهاتی شناسایی شدند. نمونه‌های گیاهی جمع‌آوری‌شده (۵۰۰ گرم) به مدت ۶ ساعت با استفاده از دستگاه کلونجر تحت تقطیر با آب قرار گرفتند. اسانس استخراج‌شده در ویال‌های شیشه‌ای تمیز جمع‌آوری و برای مطالعه بیشتر در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
سمیت لاروکشی با استفاده از رویه‌های استاندارد سازمان بهداشت جهانی با کمی اصلاح ۶۷ مورد مطالعه قرار گرفت. از DMSO به عنوان امولسیفایر استفاده کنید. هر غلظت EO در ابتدا با ۱۰۰ و ۱۰۰۰ ppm آزمایش شد و ۲۰ لارو در هر تکرار در معرض آن قرار گرفتند. بر اساس نتایج، یک محدوده غلظت اعمال شد و میزان مرگ و میر از ۱ ساعت تا ۶ ساعت (با فواصل ۱ ساعت) و در ۲۴ ساعت، ۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت پس از درمان ثبت شد. غلظت‌های زیرکشنده (LC50) پس از ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت پس از مواجهه تعیین شدند. هر غلظت به همراه یک کنترل منفی (فقط آب) و یک کنترل مثبت (آب تیمار شده با DMSO) در سه تکرار مورد سنجش قرار گرفت. اگر شفیره شدن رخ دهد و بیش از ۱۰٪ از لاروهای گروه کنترل بمیرند، آزمایش تکرار می‌شود. اگر میزان مرگ و میر در گروه کنترل بین ۵ تا ۱۰٪ باشد، از فرمول اصلاحی ابوت ۶۸ استفاده کنید.
روش شرح داده شده توسط رامار و همکاران. 69 برای سنجش زیستی بالغین علیه Aedes aegypti با استفاده از استون به عنوان حلال استفاده شد. هر EO در ابتدا علیه پشه‌های بالغ Aedes aegypti در غلظت‌های 100 و 1000 ppm آزمایش شد. 2 میلی‌لیتر از هر محلول آماده شده را روی عدد واتمن قرار دهید. 1 قطعه کاغذ صافی (اندازه 12 در 15 سانتی‌متر مربع) و اجازه دهید استون به مدت 10 دقیقه تبخیر شود. کاغذ صافی آغشته به تنها 2 میلی‌لیتر استون به عنوان کنترل استفاده شد. پس از تبخیر استون، کاغذ صافی آغشته به و کاغذ صافی کنترل در یک لوله استوانه‌ای (به عمق 10 سانتی‌متر) قرار داده شدند. ده پشه 3 تا 4 روزه غیر خونخوار به سه تکرار از هر غلظت منتقل شدند. بر اساس نتایج آزمایش‌های اولیه، غلظت‌های مختلفی از روغن‌های انتخاب شده آزمایش شدند. میزان مرگ و میر در ۱ ساعت، ۲ ساعت، ۳ ساعت، ۴ ساعت، ۵ ساعت، ۶ ساعت، ۲۴ ساعت، ۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت پس از رهاسازی پشه ثبت شد. مقادیر LC50 را برای زمان‌های مواجهه ۲۴ ساعت، ۴۸ ساعت و ۷۲ ساعت محاسبه کنید. اگر میزان مرگ و میر گروه کنترل بیش از ۲۰٪ باشد، کل آزمایش را تکرار کنید. به همین ترتیب، اگر میزان مرگ و میر در گروه کنترل بیش از ۵٪ باشد، نتایج را برای نمونه‌های تیمار شده با استفاده از فرمول ابوت ۶۸ تنظیم کنید.
کروماتوگرافی گازی (Agilent 7890A) و طیف‌سنجی جرمی (Accu TOF GCv, Jeol) برای تجزیه و تحلیل ترکیبات تشکیل‌دهنده اسانس‌های انتخاب‌شده انجام شد. دستگاه GC مجهز به آشکارساز FID و ستون مویین (HP5-MS) بود. گاز حامل هلیوم بود و سرعت جریان 1 میلی‌لیتر در دقیقه بود. برنامه GC برای Allium sativum مقادیر 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M و برای Ocimum Sainttum مقادیر 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280، برای نعناع 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280، برای اکالیپتوس 20.60-1M-10-200-3M-30-280 و برای رنگ قرمز برای هزار لایه، مقادیر 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M را تنظیم می‌کند.
ترکیبات اصلی هر اسانس بر اساس درصد مساحت محاسبه شده از کروماتوگرام GC و نتایج طیف‌سنجی جرمی (با ارجاع به پایگاه داده استانداردهای NIST 70) شناسایی شدند.
دو ترکیب اصلی در هر اسانس بر اساس نتایج GC-MS انتخاب و با خلوص 98 تا 99 درصد برای زیست‌سنجی‌های بیشتر از سیگما-آلدریچ خریداری شدند. این ترکیبات از نظر اثربخشی لاروکشی و اثر ضد لاروی در برابر پشه آئدس اجیپتی (Aedes aegypti) در بالغین، همانطور که در بالا توضیح داده شد، آزمایش شدند. رایج‌ترین لاروکش‌های مصنوعی مورد استفاده، تامفوسات (سیگما آلدریچ) و داروی ضد لاروی بزرگسالان مالاتیون (سیگما آلدریچ) برای مقایسه اثربخشی آنها با ترکیبات اسانس انتخاب شده، با همان روش، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
مخلوط‌های دوتایی از ترکیبات ترپنی منتخب و ترکیبات ترپنی به همراه ارگانوفسفات‌های تجاری (تیلفوس و مالاتیون) با مخلوط کردن دوز LC50 هر ترکیب کاندید به نسبت 1:1 تهیه شدند. ترکیبات تهیه شده بر روی مراحل لاروی و بالغ Aedes aegypti همانطور که در بالا توضیح داده شد، آزمایش شدند. هر زیست‌سنجی برای هر ترکیب در سه تکرار و برای ترکیبات منفرد موجود در هر ترکیب در سه تکرار انجام شد. مرگ حشرات هدف پس از 24 ساعت ثبت شد. میزان مرگ و میر مورد انتظار برای یک مخلوط دوتایی را با استفاده از فرمول زیر محاسبه کنید.
که در آن E = میزان مرگ و میر مورد انتظار پشه‌های Aedes aegypti در پاسخ به یک ترکیب دوتایی، یعنی اتصال (A + B).
اثر هر مخلوط دوتایی بر اساس مقدار χ2 محاسبه شده با روش شرح داده شده توسط Pavla52 به صورت سینرژیک، آنتاگونیست یا بدون اثر برچسب گذاری شد. مقدار χ2 را برای هر ترکیب با استفاده از فرمول زیر محاسبه کنید.
اثر یک ترکیب زمانی به عنوان هم‌افزایی تعریف شد که مقدار χ2 محاسبه‌شده برای درجات آزادی مربوطه (فاصله اطمینان 95٪) بیشتر از مقدار جدول باشد و اگر مرگ و میر مشاهده‌شده از مرگ و میر مورد انتظار بیشتر باشد. به طور مشابه، اگر مقدار χ2 محاسبه‌شده برای هر ترکیبی با برخی درجات آزادی از مقدار جدول بیشتر باشد، اما مرگ و میر مشاهده‌شده کمتر از مرگ و میر مورد انتظار باشد، درمان آنتاگونیستی در نظر گرفته می‌شود. و اگر در هر ترکیبی مقدار محاسبه‌شده χ2 کمتر از مقدار جدول در درجات آزادی مربوطه باشد، ترکیب هیچ تأثیری ندارد.
سه تا چهار ترکیب بالقوه هم‌افزایی (100 لارو و 50 لاروکش و حشره بالغ) برای آزمایش در برابر تعداد زیادی از حشرات انتخاب شدند. حشرات بالغ) مانند بالا عمل می‌کنند. همراه با مخلوط‌ها، ترکیبات منفرد موجود در مخلوط‌های انتخاب‌شده نیز بر روی تعداد مساوی از لاروها و حشرات بالغ Aedes aegypti آزمایش شدند. نسبت ترکیب، یک قسمت دوز LC50 از یک ترکیب کاندید و یک قسمت دوز LC50 از ترکیب تشکیل‌دهنده دیگر است. در زیست‌سنجی فعالیت حشرات بالغ، ترکیبات انتخاب‌شده در حلال استون حل شده و روی کاغذ صافی پیچیده شده در یک ظرف پلاستیکی استوانه‌ای 1300 سانتی‌متر مکعبی اعمال شدند. استون به مدت 10 دقیقه تبخیر شد و حشرات بالغ آزاد شدند. به طور مشابه، در زیست‌سنجی لاروکش، دوزهایی از ترکیبات کاندید LC50 ابتدا در حجم‌های مساوی DMSO حل شده و سپس با 1 لیتر آب ذخیره شده در ظروف پلاستیکی 1300 سی‌سی مخلوط شدند و لاروها آزاد شدند.
آنالیز احتمالاتی ۷۱ داده مرگ و میر ثبت شده با استفاده از نرم‌افزارهای SPSS (نسخه ۱۶) و Minitab برای محاسبه مقادیر LC50 انجام شد.