کشف، شناسایی و بهبود عملکردی مونوآمیدهای ursa به عنوان بازدارنده‌های جدید رشد گیاهی که بر میکروتوبول‌های گیاهی تأثیر می‌گذارند.

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد.برای بهترین نتایج، توصیه می کنیم از نسخه جدیدتر مرورگر خود استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل یا جاوا اسکریپت نشان می دهیم.
کشف و استفاده مفید از محصولات طبیعی می تواند به بهبود زندگی انسان کمک کند.مواد شیمیایی بازدارنده رشد گیاه به طور گسترده ای به عنوان علف کش برای کنترل علف های هرز استفاده می شود.با توجه به نیاز به استفاده از انواع علف کش ها، نیاز به شناسایی ترکیبات با مکانیسم های جدید اثر وجود دارد.در این مطالعه، ما یک ترکیب جدید N-alkoxypyrrole، کومامون آمید، از Streptomyces werraensis MK493-CF1 کشف کردیم و فرآیند سنتز کامل را ایجاد کردیم.از طریق سنجش فعالیت بیولوژیکی، ما کشف کردیم که urs-monoamic acid یک واسطه مصنوعی از urs-monoamide و یک پتانسیل است.بازدارنده رشد گیاه.علاوه بر این، ما مشتقات مختلف اسید اوربنیک، از جمله مشتق urbenyloxy (UDA) را ایجاد کرده‌ایم که فعالیت علف‌کشی بالایی دارد بدون اینکه تأثیر منفی بر رشد سلول‌های HeLa داشته باشد.ما همچنین دریافتیم که مشتقات اسید اوروموتونیک میکروتوبول های گیاه را مختل می کنند.علاوه بر این، KAND بر رشته های اکتین تأثیر می گذارد و باعث مرگ سلولی می شود.این اثرات چندوجهی با مهارکننده‌های میکروتوبول شناخته شده متفاوت است و مکانیسم جدیدی از عملکرد اسید اورسونیک را پیشنهاد می‌کند که نشان‌دهنده یک مزیت مهم در توسعه علف‌کش‌های جدید است.
کشف و کاربرد عملی فرآورده های طبیعی مفید و مشتقات آنها وسیله ای برای بهبود کیفیت زندگی انسان است.متابولیت های ثانویه تولید شده توسط میکروارگانیسم ها، گیاهان و حشرات منجر به پیشرفت های عمده ای در پزشکی و کشاورزی شده است.بسیاری از آنتی بیوتیک ها و داروهای ضد سرطان خون از محصولات طبیعی ساخته شده اند.علاوه بر این، انواع مختلفی ازآفت کش هاقارچ کش ها و علف کش ها از این محصولات طبیعی برای استفاده در کشاورزی استخراج می شوند.به طور خاص، علف کش های کنترل علف های هرز ابزار مهمی برای افزایش عملکرد محصول در کشاورزی مدرن هستند و انواع مختلفی از ترکیبات در حال حاضر به صورت تجاری مورد استفاده قرار می گیرند.چندین فرآیند سلولی در گیاهان، مانند فتوسنتز، متابولیسم اسیدهای آمینه، سنتز دیواره سلولی، تنظیم میتوز، سیگنال دهی هورمون گیاهی، یا سنتز پروتئین، اهداف معمولی علف کش ها در نظر گرفته می شوند.ترکیباتی که عملکرد میکروتوبول را مهار می‌کنند، دسته‌ای از علف‌کش‌ها هستند که با تأثیر بر تنظیم میتوزی بر رشد گیاه تأثیر می‌گذارند.
میکروتوبول ها اجزای اسکلت سلولی هستند و به طور گسترده در سلول های یوکاریوتی حفظ می شوند.هترودایمر توبولین از α-توبولین و β-توبولین تشکیل دهنده پروتوفیلامنت های میکروتوبول خطی تشکیل شده است که 13 پروتوفیلامان ساختاری استوانه ای را تشکیل می دهند.میکروتوبول ها نقش های متعددی را در سلول های گیاهی ایفا می کنند، از جمله تعیین شکل سلول، تقسیم سلولی و حمل و نقل درون سلولی.سلول‌های گیاهی حاوی میکروتوبول‌هایی در زیر غشای پلاسمایی اینترفاز هستند و تصور می‌شود که این میکروتوبول‌های به اصطلاح قشری سازمان‌دهی میکروفیبریل‌های سلولز را از طریق تنظیم کمپلکس‌های سنتاز سلولز کنترل می‌کنند.میکروتوبول‌های قشر سلول‌های اپیدرم ریشه، که در ناحیه ازدیاد طول سریع نوک ریشه وجود دارند، به صورت جانبی قرار دارند و میکروالیاف سلولزی از این میکروتوبول‌ها پیروی می‌کنند و جهت گسترش سلول را محدود می‌کنند و در نتیجه باعث افزایش طول سلول ناهمسانگرد می‌شوند.بنابراین، عملکرد میکروتوبول ارتباط نزدیکی با مورفولوژی گیاه دارد.جایگزینی اسیدهای آمینه در ژن‌های کدکننده توبولین باعث انحراف آرایه‌های میکروتوبول قشر مغز و رشد سمت چپ یا راست در آرابیدوپسیس 6،7 می‌شود.به طور مشابه، جهش در پروتئین‌های مرتبط با میکروتوبول که دینامیک میکروتوبول را تنظیم می‌کنند نیز می‌توانند به رشد ریشه‌ای منحرف شوند8،9،10،11،12،13.علاوه بر این، تیمار با علف‌کش‌های مختل کننده میکروتوبول‌ها مانند دیسوپیرامید، که به عنوان پرتی‌الاکلر نیز شناخته می‌شود، باعث رشد مورب سمت چپ ریشه می‌شود.این داده ها نشان می دهد که تنظیم دقیق عملکرد میکروتوبول برای تعیین جهت رشد گیاه حیاتی است.
انواع مختلفی از مهارکننده‌های میکروتوبول کشف شده‌اند و این داروها سهم قابل توجهی در تحقیقات اسکلت سلولی و همچنین در کشاورزی و پزشکی داشته‌اند.به طور خاص، ترکیبات اوریزالین، دی‌نیتروآنیلین، دی‌سوپیرامید، ترکیبات مرتبط با بنزامید و آنالوگ‌های آنها می‌توانند عملکرد میکروتوبول را مهار کرده و در نتیجه رشد گیاه را مهار کنند.بنابراین، آنها به طور گسترده ای به عنوان علف کش استفاده می شوند.با این حال، از آنجایی که میکروتوبول ها جزء مهم سلول های گیاهی و حیوانی هستند، اکثر مهارکننده های میکروتوبول برای هر دو نوع سلول سیتوتوکسیک هستند.بنابراین، با وجود کاربرد شناخته شده آنها به عنوان علف کش، تعداد محدودی از عوامل ضد میکروتوبول برای اهداف عملی استفاده می شود.
استرپتومایسس یک سرده از خانواده استرپتومایسس است که شامل باکتری های هوازی، گرم مثبت و رشته ای است و به دلیل توانایی آن در تولید طیف وسیعی از متابولیت های ثانویه شناخته شده است.بنابراین، یکی از مهم ترین منابع تولید محصولات طبیعی جدید فعال بیولوژیکی محسوب می شود.در مطالعه حاضر، ما یک ترکیب جدید به نام کومامونامید کشف کردیم که از Streptomyces werraensis MK493-CF1 و S. werraensis ISP 5486 جدا شد. مشخص شد.سنتز.اسید اورسمونیک، یک واسطه مصنوعی از اورسمونوآمید و مشتقات آن، از رشد و جوانه زنی گیاه مدل محبوب Arabidopsis thaliana جلوگیری می کند.در یک مطالعه رابطه ساختار-فعالیت، ما دریافتیم که یک ترکیب با C9 اصلاح شده به اسید اورسونیک، به نام مشتق نونیلوکسی اسید اورسونیک (KAND)، به طور قابل توجهی اثر بازدارندگی بر رشد و جوانه زنی را افزایش می دهد.قابل ذکر است که بازدارنده رشد گیاهی تازه کشف شده نیز بر رشد تنباکو و جگر تأثیر می گذارد و برای باکتری ها یا سلول های HeLa سیتوتوکسیک نیست.علاوه بر این، برخی از مشتقات اسید اوروموتونیک فنوتیپ ریشه تحریف شده را القا می کنند، که به این معنی است که این مشتقات به طور مستقیم یا غیرمستقیم بر میکروتوبول ها تأثیر می گذارند.مطابق با این ایده، مشاهدات ما از میکروتوبول‌هایی که به صورت ایمونوهیستوشیمی یا با پروتئین‌های فلورسنت برچسب‌گذاری شده‌اند نشان می‌دهد که درمان KAND میکروتوبول‌ها را پلیمریزه می‌کند.علاوه بر این، درمان با مشتقات اسید کوماموتونیک، میکروفیلامنت های اکتین را مختل کرد.بنابراین، ما یک مهارکننده رشد گیاهی جدید کشف کرده‌ایم که مکانیسم منحصر به فرد آن شامل تخریب اسکلت سلولی است.
سویه MK493-CF1 از خاک شیناگاوا-کو، توکیو جدا شد.سویه MK493-CF1 میسلیوم استرومایی با شاخه های خوب تشکیل داد.توالی جزئی ژن RNA ریبوزومی 16S (1422 جفت باز) تعیین شد.این سویه بسیار شبیه به S. werraensis است (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: سویه معمولی, 99.93%).بر اساس این نتیجه مشخص شد که این سویه ارتباط نزدیکی با سویه نوع S. werraensis دارد.بنابراین، ما به طور موقت این سویه را S. werraensis MK493-CF1 نامیدیم.S. werraensis ISP 5486T نیز همان ترکیبات زیست فعال را تولید می کند.از آنجایی که تحقیقات اولیه کمی برای به دست آوردن محصولات طبیعی از این میکروارگانیسم وجود داشت، تحقیقات شیمیایی بیشتری انجام شد.پس از کشت S. werraensis MK493-CF1 در محیط جو با تخمیر حالت جامد در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 14 روز، محیط با 50 درصد EtOH استخراج شد.60 میلی لیتر از نمونه خشک شد تا 59.5 میلی گرم عصاره خام بدست آید.عصاره خام در معرض HPLC فاز معکوس قرار گرفت تا N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1، به نام کومامونامید، 36.0 میلی گرم) به دست آید.مقدار کل 1 تقریباً 60 درصد عصاره خام است.بنابراین، تصمیم گرفتیم خواص کوماموتوآمید 1 را با جزئیات مطالعه کنیم.
کومامونامید 1 یک پودر آمورف سفید است و طیف سنجی جرمی با وضوح بالا (HRESIMS) C6H8N2O2 را تایید می کند (شکل 1).قطعه پیرول جایگزین شده با C2 این ترکیب با δH 6.94 (1H، t، J = 2.8، 4.8 هرتز، H-4)، δH 6.78 (1H، d، J = 2.5، δH در طیف 1H NMR: 4.5 هرتز مشخص می شود. ، H-5) و δH 6.78 (1H، d، J = 2.5 هرتز، H-6)، و طیف 13C NMR حضور چهار اتم کربن sp2 را نشان می دهد.حضور یک گروه آمید در موقعیت C2 توسط همبستگی HMBC از پروتون C-3 به کربن کربنیل آمید در δC 161.1 ارزیابی شد.علاوه بر این، قله های 1H و 13 C NMR در δH 4.10 (3H، S) و δC 68.3 نشان دهنده حضور گروه های N-متوکسی در مولکول است.اگرچه موقعیت صحیح گروه متوکسی هنوز با استفاده از آنالیز طیف‌سنجی مانند طیف‌سنجی تفاوت افزایش یافته و مخفف Overhauser هسته‌ای (NOEDF) تعیین نشده بود، N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide اولین ترکیب کاندید شد.
برای تعیین ساختار صحیح 1، یک سنتز کل انجام شد (شکل 2a).تیمار 2-آمینو پیریدین 2 تجاری موجود با m-CPBA منجر به N-اکسید 3 مربوطه در عملکرد کمی شد.پس از 2-آمینوآزیداسیون 2، واکنش سیکلوکندانس توصیف شده توسط آبراموویچ در بنزن در دمای 90 درجه سانتیگراد انجام شد تا 1-هیدروکسی-1H-پیرول-2-کربونیتریل 5 مورد نظر در گرم به دست آید.سرعت 60% (دو مرحله).15،16.متیلاسیون و هیدرولیز 4 سپس اسید 1-متوکسی-1H-پیرول-2-کربوکسیلیک (که "اسید کوموتونیک" نامیده می شود، 6) را با عملکرد خوب (70٪، دو مرحله) داد.در نهایت، آمیداسیون از طریق اسید کلرید میانی 6 با استفاده از آمونیاک آبی به کوماموتو آمید 1 در بازده 98 درصد داد.تمام داده های طیفی 1 سنتز شده مشابه 1 جدا شده بود، بنابراین ساختار 1 تعیین شد.
سنتز و تجزیه و تحلیل عمومی فعالیت بیولوژیکی اوربنامید و اسید اوربنیک.(الف) سنتز کامل آمید کوماموتو.(ب) نهال های هفت روزه نوع وحشی Arabidopsis Columbia (Col) روی صفحات موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی کومامونامید 6 یا کومامون آمید 1 در غلظت های نشان داده شده رشد داده شدند.نوار مقیاس = 1 سانتی متر.
ابتدا، فعالیت‌های بیولوژیکی urbenamide و واسطه‌های آن را برای توانایی آنها در تعدیل رشد گیاه ارزیابی کردیم.غلظت های مختلف اورسمونامید 1 یا اورسمونیک اسید 6 را به محیط کشت MS آگار اضافه کردیم و نهال های آرابیدوپسیس تالیانا را روی این محیط کشت دادیم.این سنجش ها نشان داد که غلظت های بالا (500 میکرومولار) از 6 رشد ریشه را مهار می کند (شکل 2b).در مرحله بعد، ما مشتقات مختلفی را با جایگزین کردن موقعیت N1 6 ایجاد کردیم و مطالعات رابطه ساختار-فعالیت را روی آنها انجام دادیم (فرایند سنتز آنالوگ در اطلاعات پشتیبانی (SI) توضیح داده شده است).نهال‌های آرابیدوپسیس در محیطی حاوی 50 میکرومولار مشتقات اسید اورسونیک رشد کردند و طول ریشه اندازه‌گیری شد.همانطور که در تصویر نشان داده شده است.همانطور که در شکل های 3a، b و S1 نشان داده شده است، اسیدهای کومامو دارای طول های مختلف زنجیره های آلکوکسی خطی (9، 10، 11، 12، و 13) یا زنجیره های بزرگ آلکوکسی (15، 16، و 17) در موقعیت N1 هستند.مشتقات مهار قابل توجهی از رشد ریشه را نشان دادند.علاوه بر این، ما دریافتیم که کاربرد 200 میکرومولار 10، 11 یا 17 جوانه زنی را مهار می کند (شکل 3c و S2).
مطالعه رابطه ساختار-فعالیت آمید کوماموتو و ترکیبات مرتبط(الف) ساختار و طرح سنتز آنالوگ ها.(ب) تعیین کمیت طول ریشه نهال های 7 روزه رشد یافته در محیط کشت MS با یا بدون 50 میکرومولار مشتقات کومامون آمید.ستاره ها تفاوت معنی داری را با درمان ساختگی نشان می دهند (آزمون t، p< 0.05).n>18. داده ها به صورت میانگین ± SD نشان داده شده اند.nt به معنای "تست نشده" است زیرا بیش از 50 درصد بذرها جوانه نزده اند.(ج) کمی سرعت جوانه زنی بذرهای تیمار شده به مدت 7 روز در محیط کشت MS با یا بدون 200 میکرومولار کومامونامید و ترکیبات مربوطه انکوبه شده اند.ستاره ها نشان دهنده تفاوت معنی دار با درمان شم (آزمون کای اسکوئر) هستند.n=96.
جالب توجه است که افزودن زنجیره های جانبی آلکیل طولانی تر از C9 باعث کاهش فعالیت بازدارندگی می شود، که نشان می دهد ترکیبات مرتبط با اسید کوماموتوئیک برای نشان دادن فعالیت بیولوژیکی خود به زنجیره های جانبی با اندازه معین نیاز دارند.
از آنجایی که تجزیه و تحلیل رابطه ساختار-فعالیت نشان داد که C9 به اسید اورسونیک تغییر یافته و مشتق نونیلوکسی اسید اورسونیک (که از این به بعد KAND 11 نامیده می شود) موثرترین بازدارنده رشد گیاه است، ما توصیف دقیق تری از KAND 11 انجام دادیم. درمان آرابیدوپسیس با 50 میکرومولار KAND 11 تقریباً به طور کامل از جوانه زنی جلوگیری کرد، در حالی که غلظت های پایین تر (40، 30، 20 یا 10 میکرومولار) KAND 11 رشد ریشه را به روشی وابسته به دوز مهار کرد (شکل 4a، b).برای آزمایش اینکه آیا KAND 11 بر زنده ماندن مریستم ریشه تأثیر می‌گذارد، مریستم‌های ریشه رنگ‌شده با پروپیدیوم یدید (PI) را بررسی کردیم و اندازه سطح مریستم را اندازه‌گیری کردیم.اندازه مریستم نهال های رشد یافته در محیطی حاوی 25 میکرومولار KAND-11 5/32 ± 1/151 میکرومتر بود، در حالی که اندازه مریستم نهال های رشد یافته در محیط کنترل حاوی DMSO 8/30 ± 7/264 میکرومتر بود (شکل 4c، d). ، که نشان می دهد KAND-11 فعالیت سلولی را بازیابی می کند.در حال گسترشمریستم ریشهمطابق با این، تیمار KAND 11 میزان نشانگر تقسیم سلولی CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS را در مریستم ریشه کاهش داد (شکل 4e) 17.این نتایج نشان می دهد که KAND 11 با کاهش فعالیت تکثیر سلولی، رشد ریشه را مهار می کند.
تجزیه و تحلیل اثر مهاری مشتقات اسید اوربنونیک (مشتقات اوربنیلوکسی) بر رشد.(الف) نهال‌های کول نوع وحشی 7 روزه که روی صفحات MS با غلظت‌های مشخص شده KAND 11 رشد کرده‌اند. نوار مقیاس = 1 سانتی‌متر.(ب) کمی طول ریشه.حروف تفاوت های قابل توجهی را نشان می دهد (Tukey HSD test, p< 0.05).n>16. داده ها به صورت میانگین ± SD نشان داده شده اند.(ج) میکروسکوپ کانفوکال ریشه‌های کول نوع وحشی رنگ‌آمیزی شده با یدید پروپیدیوم که روی صفحات MS با یا بدون 25 میکرومولار KAND 11 رشد کرده‌اند. براکت‌های سفید نشان‌دهنده مریستم ریشه هستند.نوار مقیاس = 100 میکرومتر.(د) تعیین کمیت اندازه مریستم ریشه (n = 10 تا 11).تفاوت های آماری با استفاده از آزمون t تعیین شد (ص< 0.05).میله ها نشان دهنده اندازه متوسط ​​مریستم هستند.(ه) میکروسکوپ کنتراست تداخل دیفرانسیل (DIC) مریستم ریشه حاوی ساختار CDKB2.1pro: CDKB2؛1-GUS رنگ آمیزی و رنگ آمیزی بر روی نهال های 5 روزه رشد یافته در صفحات MS با یا بدون آزمون KAND 25 میکرومولار انجام شد.
سمیت گیاهی KAND 11 با استفاده از یک گیاه دو لپه ای دیگر، تنباکو (Nicotiana tabacum)، و ارگانیسم مدل گیاهی اصلی زمین، جگر (Marchantia polymorpha) بیشتر مورد آزمایش قرار گرفت.همانطور که در مورد آرابیدوپسیس، نهال های توتون SR-1 روی محیط کشت حاوی 25 میکرومولار KAND 11 رشد کردند، ریشه های کوتاه تری تولید کردند (شکل 5a).علاوه بر این، 40 بذر از 48 بذر روی صفحات حاوی 200 میکرومولار KAND 11 جوانه زدند، در حالی که همه 48 بذر در محیط کشت ساختگی جوانه زدند، که نشان می دهد غلظت های بالاتر KAND معنی دار بود (p< 0.05;تست chi-square) از جوانه زنی تنباکو جلوگیری کرد.(شکل 5b).علاوه بر این، غلظت KAND 11 که رشد باکتری را در گیاه کبد مهار می کند مشابه غلظت موثر در Arabidopsis بود (شکل 5c).این نتایج نشان می دهد که KAND 11 می تواند از رشد انواع گیاهان جلوگیری کند.سپس سمیت سلولی احتمالی ترکیبات مرتبط با مونوآمید خرس را در سایر ارگانیسم‌ها، یعنی سلول‌های HeLa انسانی و سویه Escherichia coli DH5α، به ترتیب به عنوان نمایندگان سلول‌های حیوانی و باکتریایی بالاتر بررسی کردیم.در یک سری از سنجش تکثیر سلولی، مشاهده کردیم که کومامونامید 1، کومامون آمیدیک اسید 6، و KAND 11 بر رشد سلول های HeLa یا E. coli در غلظت های 100 میکرومولار تأثیری نداشتند (شکل 5d، e).
مهار رشد KAND 11 در ارگانیسم های غیر آرابیدوپسیس.(الف) نهال‌های تنباکوی نوع وحشی SR-1 دو هفته‌ای بر روی صفحات MS با موقعیت عمودی حاوی 25 میکرومولار KAND 11 رشد کردند. صفحات MS حاوی 200 میکرومولار KAND 11. (ج) جوانه‌های دو هفته‌ای تک-1 نوع وحشی کبد رشد کرده روی صفحات Gamborg B5 با غلظت‌های نشان‌داده‌شده KAND 11. فلش‌های قرمز اسپورهایی را نشان می‌دهند که در طی دو هفته انکوباسیون متوقف شده‌اند. دوره زمانی.(د) سنجش تکثیر سلولی سلول‌های HeLa.تعداد سلول های زنده در فواصل زمانی ثابت با استفاده از کیت شمارش سلولی 8 (Dojindo) اندازه گیری شد.به عنوان شاهد، سلول های HeLa با 5 میکروگرم بر میلی لیتر اکتینومایسین D (Act D) تیمار شدند که رونویسی RNA پلیمراز را مهار می کند و باعث مرگ سلولی می شود.آنالیزها در سه تکرار انجام شد.(ه) سنجش تکثیر سلولی E. coli.رشد E. coli با اندازه گیری OD600 آنالیز شد.به عنوان شاهد، سلول ها با 50 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین (Amp) تیمار شدند که سنتز دیواره سلولی باکتری را مهار می کند.آنالیزها در سه تکرار انجام شد.
برای رمزگشایی مکانیسم اثر سمیت سلولی ناشی از ترکیبات مرتبط با اورامید، مشتقات اسید اوربنیک با اثرات بازدارندگی متوسط ​​را مجدداً تجزیه و تحلیل کردیم.همانطور که در تصویر نشان داده شده است.همانطور که در شکل های 2b، 6a نشان داده شده است، نهال های رشد یافته در صفحات آگار حاوی غلظت های بالا (200 میکرومولار) اسید اورموتونیک 6، ریشه های کوتاه تر و منحنی سمت چپ تولید کردند (6.1 ± 23.7--θ = θ)، در حالی که نهال های رشد یافته در محیط کنترل، نهال ها ریشه تقریباً مستقیم تولید کردند (7.1 ± 3.8 - θ =).شناخته شده است که این رشد مورب مشخصه ناشی از اختلال عملکرد میکروتوبول‌های قشر مغز است 14،18.مطابق با این یافته، داروهای بی ثبات کننده میکروتوبول دیسوپیرامید و اوریزالین باعث کج شدن ریشه مشابه در شرایط رشد ما شدند (شکل 2b، 6a).در همان زمان، مشتقات اسید اوروموتونیک را آزمایش کردیم و چندین مورد از آنها را انتخاب کردیم که در غلظت‌های معین، باعث رشد مورب ریشه می‌شدند.ترکیبات 8، 9 و 15 جهت رشد ریشه را به ترتیب در 75 میکرومولار، 50 میکرومولار و 40 میکرومولار تغییر دادند که نشان می‌دهد این ترکیبات می‌توانند به طور موثر میکروتوبول‌ها را بی‌ثبات کنند (شکل 2b، 6a).ما همچنین قوی ترین مشتق اسید اورسولیک، KAND 11 را در غلظت کمتر (15 میکرومولار) آزمایش کردیم و دریافتیم که استفاده از KAND 11 رشد ریشه را مهار می کند و جهت رشد ریشه ناهموار است، اگرچه آنها تمایل به شیب به سمت چپ داشتند. شکل C3)..از آنجا که غلظت‌های بالاتر داروهای بی‌ثبات‌کننده میکروتوبول‌ها گاهی اوقات رشد گیاه را مهار می‌کنند تا اینکه باعث کج شدن ریشه شوند، ما متعاقباً این احتمال را ارزیابی کردیم که KAND 11 با مشاهده میکروتوبول‌های قشر در سلول‌های اپیدرمی ریشه بر میکروتوبول‌ها تأثیر می‌گذارد.ایمونوهیستوشیمی با استفاده از آنتی بادی های ضد β-توبولین در سلول های اپیدرمی ریشه نهال تیمار شده با 25 میکرومولار KAND 11 ناپدید شدن تقریباً همه میکروتوبول های قشری را در سلول های اپیدرمی در ناحیه طویل شدن نشان داد (شکل 6b).این نتایج نشان می دهد که اسید کوماموتونیک و مشتقات آن به طور مستقیم یا غیرمستقیم روی میکروتوبول ها عمل می کنند تا آنها را مختل کنند و این ترکیبات بازدارنده های جدید میکروتوبول هستند.
اسید اورسونیک و مشتقات آن میکروتوبول‌های قشر مغز را در Arabidopsis thaliana تغییر می‌دهند.(الف) زاویه تمایل ریشه در حضور مشتقات مختلف اسید اوروموتونیک در غلظت‌های مشخص شده اندازه‌گیری می‌شود.اثرات دو ترکیب شناخته شده برای مهار میکروتوبول ها: دیسوپیرامید و اوریزالین نیز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.اینست استاندارد مورد استفاده برای اندازه گیری زاویه رشد ریشه را نشان می دهد.ستاره ها تفاوت معنی داری را با درمان ساختگی نشان می دهند (آزمون t، p< 0.05).n>19. نوار مقیاس = 1 سانتی متر.(ب) میکروتوبول های قشری در سلول های اپیدرمی در ناحیه کشیدگی.میکروتوبول‌ها در ریشه‌های نوع وحشی Arabidopsis Col رشد یافته روی صفحات MS با یا بدون 25 میکرومولار KAND 11 با رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی با استفاده از آنتی‌بادی‌های اولیه β-توبولین و آنتی‌بادی‌های ثانویه کونژوگه با فلور الکسا مشاهده شدند.نوار مقیاس = 10 میکرومتر.(ج) ساختار میتوزی میکروتوبول ها در مریستم ریشه.میکروتوبول ها با استفاده از رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی مشاهده شدند.ساختارهای میتوزی، از جمله مناطق پروفاز، دوک ها، و فراگموپلاست، از تصاویر هم کانونی شمارش شدند.فلش ها ساختار میکروتوبول میتوزی را نشان می دهد.ستاره ها تفاوت معنی داری را با درمان ساختگی نشان می دهند (آزمون t، p< 0.05).n>9. نوار مقیاس = 50 میکرومتر.
اگرچه Ursa توانایی مختل کردن عملکرد میکروتوبول را دارد، انتظار می‌رود مکانیسم اثر آن متفاوت از عوامل پلیمریزاسیون میکروتوبول معمولی باشد.به عنوان مثال، غلظت های بالاتر از عوامل پلیمریزه کننده میکروتوبول مانند دیسوپیرامید و اوریزالین باعث گسترش ناهمسانگرد سلول های اپیدرمی می شود، در حالی که KAND 11 چنین نیست.علاوه بر این، استفاده همزمان از KAND 11 و دیسوپیرامید منجر به یک پاسخ رشد ریشه ناشی از دیسوپیرامید ترکیبی شد و مهار رشد ناشی از KAND 11 مشاهده شد (شکل S4).ما همچنین پاسخ جهش یافته دیسوپیرامید 1-1 (phs1-1) را به KAND 11 تجزیه و تحلیل کردیم.نهال‌های جهش یافته phs1-1 روی محیط کشت آگار حاوی KAND 11 ریشه‌های کوتاه‌تری شبیه به ریشه‌های رشد یافته روی دی‌سوپیرامید داشتند (شکل S5).
علاوه بر این، ما ساختارهای میکروتوبول میتوزی، مانند نواحی پروفاز، دوک‌ها، و فراگموپلاست‌ها را در مریستم ریشه نهال‌های تیمار شده با KAND 11 مشاهده کردیم. مطابق با مشاهدات برای CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS، کاهش قابل‌توجهی در تعداد ریز لوله های میتوزی مشاهده شد (شکل .6c).
برای مشخص کردن سمیت سلولی KAND 11 در وضوح درون سلولی، سلول‌های تعلیق BY-2 تنباکو را با KAND 11 درمان کردیم و پاسخ آنها را مشاهده کردیم.ما ابتدا KAND 11 را به سلول‌های BY-2 اضافه کردیم که TagRFP-TUA6 را بیان می‌کنند، که میکروتوبول‌ها را به‌صورت فلورسنت برچسب‌گذاری می‌کند، تا اثر KAND 11 را بر روی میکروتوبول‌های قشر مغز ارزیابی کنیم.چگالی میکروتوبول قشر مغز با استفاده از تجزیه و تحلیل تصویر، که درصد پیکسل های اسکلت سلولی را در بین پیکسل های سیتوپلاسمی تعیین می کند، ارزیابی شد.نتایج سنجش نشان داد که پس از تیمار با 50 میکرومولار یا 100 میکرومولار KAND 11 به مدت 1 ساعت، تراکم به ترتیب به 74/0 ± 94/0 درصد یا 28/0 ± 23/0 درصد کاهش یافت، در حالی که تراکم سلول‌های تیمار شده با DMSO 631/0 ± شد. % (شکل 7a).این نتایج با مشاهدات در Arabidopsis که درمان KAND 11 باعث پلیمریزاسیون میکروتوبول های قشر مغز می شود مطابقت دارد (شکل 6b).ما همچنین خط BY-2 را با رشته های اکتین نشاندار شده با GFP-ABD پس از درمان با همان غلظت KAND 11 بررسی کردیم و مشاهده کردیم که درمان KAND 11 رشته های اکتین را مختل می کند.تیمار با 50 میکرومولار یا 100 میکرومولار KAND 11 به مدت 1 ساعت به طور قابل توجهی چگالی رشته اکتین را به ترتیب به 0.62 ± 1.20 درصد یا 0.26 ± 0.61 درصد کاهش داد، در حالی که تراکم در سلول های تیمار شده با DMSO 1.69 ± 0.52 درصد بود (شکل 0.51 ± 1.69).7 ب).این نتایج با اثرات پروپیزامید، که بر رشته‌های اکتین تأثیر نمی‌گذارد، و لاترونکولین B، یک پلی‌مریزکننده اکتین که بر میکروتوبول‌ها تأثیر نمی‌گذارد، در تضاد است (SI شکل S6).علاوه بر این، درمان با کومامونامید 1، کومامون آمید اسید 6 یا KAND 11 بر میکروتوبول های سلول های HeLa تأثیری نداشت (SI شکل S7).بنابراین، اعتقاد بر این است که مکانیسم عمل KAND 11 با مختل کننده های اسکلت سلولی شناخته شده متفاوت است.علاوه بر این، مشاهده میکروسکوپی ما از سلول‌های BY-2 تیمار شده با KAND 11 شروع مرگ سلولی را در طول درمان KAND 11 نشان داد و نشان داد که نسبت سلول‌های مرده آبی رنگ‌آمیزی Evans پس از 30 دقیقه از درمان KAND 11 به طور قابل‌توجهی افزایش نمی‌یابد، در حالی که پس از 90 دقیقه تیمار با 50 میکرومولار یا 100 میکرومولار KAND، تعداد سلول‌های مرده به ترتیب به 7/43 درصد یا 1/80 درصد افزایش یافت (شکل 7 ج).روی هم رفته، این داده‌ها نشان می‌دهند که مشتق اسید اورسولیک جدید KAND 11 یک مهارکننده اسکلت سلولی خاص گیاهی با مکانیسم عمل ناشناخته قبلی است.
KAND بر میکروتوبول های قشر مغز، رشته های اکتین و زنده ماندن سلول های BY-2 تنباکو تأثیر می گذارد.(الف) تجسم میکروتوبول های قشر مغز در سلول های BY-2 در حضور TagRFP-TUA6.سلول های BY-2 تیمار شده با KAND 11 (50 میکرومولار یا 100 میکرومولار) یا DMSO توسط میکروسکوپ کانفوکال مورد بررسی قرار گرفتند.چگالی میکروتوبول قشر مغز از میکروگراف 25 سلول مستقل محاسبه شد.حروف تفاوت های قابل توجهی را نشان می دهد (Tukey HSD test, p< 0.05).نوار مقیاس = 10 میکرومتر.(ب) رشته‌های اکتین قشری در سلول‌های BY-2 که در حضور GFP-ABD2 مشاهده می‌شوند.سلول های BY-2 تیمار شده با KAND 11 (50 میکرومولار یا 100 میکرومولار) یا DMSO توسط میکروسکوپ کانفوکال مورد بررسی قرار گرفتند.چگالی رشته های اکتین قشر مغز از میکروگراف های 25 سلول مستقل محاسبه شد.حروف تفاوت های قابل توجهی را نشان می دهد (Tukey HSD test, p< 0.05).نوار مقیاس = 10 میکرومتر.(ج) مشاهده سلول های مرده BY-2 با رنگ آمیزی آبی ایوانز.سلول های BY-2 تیمار شده با KAND 11 (50 میکرومولار یا 100 میکرومولار) یا DMSO توسط میکروسکوپ میدان روشن مورد بررسی قرار گرفتند.n=3.نوار مقیاس = 100 میکرومتر.
کشف و کاربرد محصولات طبیعی جدید منجر به پیشرفت های چشمگیری در جنبه های مختلف زندگی بشر از جمله پزشکی و کشاورزی شده است.تحقیقات تاریخی برای به دست آوردن ترکیبات مفید از منابع طبیعی انجام شده است.به طور خاص، اکتینومیست ها به دلیل توانایی آنها در تولید متابولیت های ثانویه مختلف مانند اورمکتین، ترکیب سرب ایورمکتین و بلئومایسین و مشتقات آن که در پزشکی به عنوان یک عامل ضد سرطان استفاده می شود، به عنوان آنتی بیوتیک های ضد انگلی برای نماتدها مفید شناخته شده اند.به همین ترتیب، انواع ترکیبات علف کش از اکتینومیست ها کشف شده است که برخی از آنها قبلاً به صورت تجاری استفاده می شوند.بنابراین، تجزیه و تحلیل متابولیت های اکتینومیست برای جداسازی محصولات طبیعی با فعالیت های بیولوژیکی مطلوب، یک استراتژی موثر در نظر گرفته می شود.در این مطالعه، ترکیب جدیدی به نام کومامونامید را از S. werraensis کشف کردیم و با موفقیت آن را سنتز کردیم.اسید اورسونیک یک واسطه مصنوعی از urbenamide و مشتقات آن است.می تواند باعث پیچ خوردگی مشخص ریشه شود، فعالیت علف کشی متوسط ​​تا قوی نشان دهد و به طور مستقیم یا غیرمستقیم به میکروتوبول های گیاه آسیب برساند.با این حال، مکانیسم اثر اسید اوروموتونیک ممکن است با مهارکننده‌های میکروتوبول موجود متفاوت باشد، زیرا KAND 11 همچنین رشته‌های اکتین را مختل می‌کند و باعث مرگ سلولی می‌شود، که مکانیسم تنظیمی را نشان می‌دهد که توسط آن اسید اورموتونیک و مشتقات آن بر طیف وسیعی از ساختارهای اسکلت سلولی تأثیر می‌گذارد..
توصیف دقیق تر اسید اوربنیک به درک بهتر مکانیسم عمل اسید اوربنونیک کمک می کند.به طور خاص، هدف بعدی ارزیابی توانایی اسید اورسونیک برای اتصال به میکروتوبول‌های کاهش‌یافته است تا مشخص شود آیا اسید اورسونیک و مشتقات آن مستقیماً روی میکروتوبول‌ها اثر می‌کنند و آنها را پلیمریزه می‌کنند یا اینکه آیا عمل آنها منجر به بی‌ثباتی میکروتوبول می‌شود.علاوه بر این، در مواردی که میکروتوبول ها یک هدف مستقیم نیستند، شناسایی محل عمل و اهداف مولکولی اسید اورسونیک روی سلول های گیاهی به درک بیشتر خواص ترکیبات مرتبط و راه های ممکن برای بهبود فعالیت علف کش کمک می کند.سنجش زیست فعالی ما توانایی سیتوتوکسیک منحصر به فرد اسید اورسونیک را در رشد گیاهانی مانند Arabidopsis thaliana، تنباکو و جگر نشان داد، در حالی که نه سلول های E. coli و نه سلول های HeLa تحت تأثیر قرار نگرفتند.اگر به عنوان علف کش برای استفاده در مزارع کشاورزی باز تولید شوند، سمیت کم یا بدون سمیت برای سلول های حیوانی مزیت مشتقات اسید اورسونیک است.در واقع، از آنجایی که میکروتوبول ها ساختارهای رایج در یوکاریوت ها هستند، مهار انتخابی آنها در گیاهان یک نیاز کلیدی برای علف کش ها است.به عنوان مثال، پروپیزامید، یک عامل پلیمریزاسیون میکروتوبولی که مستقیماً به توبولین متصل می شود و پلیمریزاسیون را مهار می کند، به دلیل سمیت کم برای سلول های حیوانی به عنوان علف کش استفاده می شود.در مقابل دیسوپیرامید، بنزامیدهای مرتبط دارای ویژگی های هدف متفاوتی هستند.علاوه بر میکروتوبول های گیاهی، RH-4032 یا بنزوکسامید نیز به ترتیب میکروتوبول های سلول های حیوانی یا اومیست ها را مهار می کند و زالیلامید به دلیل سمیت گیاهی کم به عنوان قارچ کش استفاده می شود25،26،27.خرس تازه کشف شده و مشتقات آن سمیت سلولی انتخابی را علیه گیاهان نشان می دهند، اما شایان ذکر است که تغییرات بیشتر ممکن است ویژگی هدف آنها را تغییر دهد و به طور بالقوه مشتقات اضافی برای کنترل قارچ های بیماری زا یا اوومیست ها فراهم کند.
خواص منحصر به فرد اسید اوربنیک و مشتقات آن برای توسعه آنها به عنوان علف کش و استفاده به عنوان ابزار تحقیق مفید است.اهمیت اسکلت سلولی در کنترل شکل سلول های گیاهی به طور گسترده ای شناخته شده است.مطالعات قبلی نشان داده‌اند که گیاهان مکانیسم‌های پیچیده سازمان‌دهی میکروتوبول‌های قشر مغز را با کنترل دینامیک میکروتوبول‌ها برای کنترل درست مورفوژنز تکامل داده‌اند.تعداد زیادی از مولکول‌های مسئول تنظیم فعالیت میکروتوبول‌ها شناسایی شده‌اند و تحقیقات مرتبط هنوز در حال انجام است3،4،28.درک فعلی ما از دینامیک میکروتوبول ها در سلول های گیاهی مکانیسم های سازمان دهی میکروتوبول های قشر مغز را به طور کامل توضیح نمی دهد.به عنوان مثال، اگرچه هم دیسوپیرامید و هم اوریزالین می توانند میکروتوبول ها را پلیمریزه کنند، دیزوپیرامید باعث اعوجاج شدید ریشه می شود در حالی که اوریزالین اثر نسبتاً ملایمی دارد.علاوه بر این، جهش در توبولین، که میکروتوبول‌ها را تثبیت می‌کند، همچنین باعث چرخش دکسترو در ریشه‌ها می‌شود، در حالی که پاکلیتاکسل، که دینامیک میکروتوبول‌ها را نیز تثبیت می‌کند، این کار را انجام نمی‌دهد.بنابراین، مطالعه و شناسایی اهداف مولکولی اسید اورسولیک باید بینش جدیدی در مورد تنظیم میکروتوبول‌های قشر گیاهی ارائه دهد.به همین ترتیب، مقایسه‌های آتی مواد شیمیایی مؤثر در تقویت رشد تحریف‌شده، مانند دی‌سوپیرامید، و مواد شیمیایی کمتر مؤثر، مانند اوریزالین یا اسید کوماموتوریک، سرنخ‌هایی از چگونگی ایجاد تحریف رشد ارائه می‌دهد.
از سوی دیگر، بازآرایی های اسکلت سلولی مرتبط با دفاع امکان دیگری برای توضیح سمیت سلولی اسید اورسونیک است.عفونت یک پاتوژن یا وارد کردن یک عامل تحریک کننده به سلول های گیاهی گاهی باعث تخریب اسکلت سلولی و متعاقب آن مرگ سلولی می شود.به عنوان مثال، گزارش شده است که کریپتوکسانتین مشتق شده از اوومیستین، میکروتوبول ها و رشته های اکتین را قبل از مرگ سلولی تنباکو مختل می کند، مشابه آنچه در درمان KAND رخ می دهد30،31.شباهت‌های بین پاسخ‌های دفاعی و پاسخ‌های سلولی ناشی از اسید اورسونیک، ما را به این فرضیه سوق داد که آنها فرآیندهای سلولی رایجی را آغاز می‌کنند، اگرچه اثر سریع‌تر و قوی‌تر اسید اورسونیک نسبت به کریپتوکسانتین مشهود است.با این حال، مطالعات نشان داده‌اند که اختلال در رشته‌های اکتین باعث مرگ سلولی خود به خودی می‌شود که همیشه با اختلال میکروتوبول همراه نیست.علاوه بر این، باید دید که آیا عامل بیماریزا یا ایجاد کننده باعث ایجاد اختلال در رشد ریشه می شود، همانطور که مشتقات اسید اورسونیک انجام می دهند.بنابراین، دانش مولکولی مرتبط با پاسخ‌های دفاعی و اسکلت سلولی یک مشکل جذاب است که باید به آن پرداخت.با بهره‌برداری از حضور ترکیبات با وزن مولکولی کم مرتبط با اسید اورسونیک، و همچنین طیف وسیعی از مشتقات با قدرت‌های مختلف، ممکن است فرصت‌هایی برای هدف قرار دادن مکانیسم‌های سلولی ناشناخته فراهم کنند.
روی هم رفته، کشف و بکارگیری ترکیبات جدیدی که دینامیک میکروتوبول را تعدیل می‌کنند، روش‌های قدرتمندی را برای رسیدگی به مکانیسم‌های مولکولی پیچیده زیربنایی تعیین شکل سلول‌های گیاهی ارائه می‌دهد.در این زمینه، ترکیب اسید اوروموتونیک اخیراً توسعه‌یافته، که بر میکروتوبول‌ها و رشته‌های اکتین تأثیر می‌گذارد و باعث مرگ سلولی می‌شود، ممکن است فرصتی برای رمزگشایی ارتباط بین کنترل میکروتوبول و این مکانیسم‌های دیگر فراهم کند.بنابراین، تجزیه و تحلیل شیمیایی و بیولوژیکی با استفاده از اسید اوربنیک به ما در درک مکانیسم‌های تنظیمی مولکولی که اسکلت سلولی گیاه را کنترل می‌کنند، کمک می‌کند.
S. werraensis MK493-CF1 را در یک ارلن بافل دار 500 میلی لیتری حاوی 110 میلی لیتر محیط بذر شامل 2% گالاکتوز، 2% خمیر اسانس، 1% (وزنی/حجمی) گالاکتوز تلقیح کنید. .-سویتون (Thermo Fisher Scientific, Inc.)، 0.5% (w/v) عصاره ذرت (KOGOSTCH Co., Ltd.، ژاپن)، 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 و 0.2% CaCO3 در آب دیونیزه.(pH 7.4 قبل از استریلیزاسیون).کشت های بذر روی شیکر چرخشی (180 دور در دقیقه) در دمای 27 درجه سانتی گراد به مدت 2 روز انکوبه شدند.کشت تولیدی از طریق تخمیر حالت جامد.کشت بذر (7 میلی لیتر) به یک فلاسک 500 میلی لیتری K-1 حاوی 40 گرم محیط تولید شامل 15 گرم جو فشرده (MUSO Co., Ltd., Japan) و 25 گرم آب دیونیزه (PH تنظیم نشده) منتقل شد. قبل از عقیم سازی).).تخمیر در دمای 30 درجه سانتیگراد در تاریکی به مدت 14 روز انجام شد.مواد تخمیر با 40 میلی لیتر EtOH در بطری استخراج و سانتریفیوژ شد (1500 گرم، 4 درجه سانتی گراد، 10 دقیقه).مایع رویی کشت (60 میلی لیتر) با مخلوط 10 درصد MeOH/EtOAc استخراج شد.لایه آلی تحت فشار کاهش یافته تبخیر شد تا باقیمانده ای به دست آید (59.5 میلی گرم)، که تحت HPLC با شستشوی گرادیان (0-10 دقیقه: 90٪) روی ستون فاز معکوس قرار گرفت (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120، 5 میکرومتر، ID 10 میلی متر × طول 250 میلی متر) H2O/CH3CN، 10-35 دقیقه: 90٪ H2O/CH3CN تا 70٪ H2O/CH3CN (گرید)، 35-45 دقیقه: 90٪ H2O/EtOH، 45-155 دقیقه: 90٪ H2O / EtOH به 100٪ EtOH ( گرادیان ( گرادیان)، 155-200 دقیقه: 100٪ EtOH) با سرعت جریان 1.5 میلی لیتر در دقیقه، کومامونامید (1، 36.0 میلی گرم) به عنوان یک پودر آمورف سفید جدا شد.
کوماموتوآمید (1)؛1H-NMR (500 مگاهرتز، CDCl3) δ 6.93 (t، J = 2.5 هرتز، 1H)، 6.76 (dd، J = 4.3، 1.8 هرتز 1H)، 6.05 (t، J = 3.8 هرتز، 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 مگاهرتز، CDCl3) δ 161.1، 121.0، 119.9، 112.2، 105.0، 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ مقدار محاسبه شده: 141.0659، مقدار اندازه گیری شده: 141.0663، IR νmax 3451، 3414، 3173، 2938، 1603، 1593، 153-153 سانتی متر
دانه های کلمبیا (Col-0) از مرکز منابع زیستی آرابیدوپسیس (ABRC) با مجوز برای استفاده تحقیقاتی به دست آمد.بذرهای Col-0 تحت شرایط آزمایشگاهی ما تکثیر و نگهداری شدند و به عنوان گیاهان نوع وحشی Arabidopsis مورد استفاده قرار گرفتند.بذرهای آرابیدوپسیس استریل سطحی شدند و در محیط کشت نیمه قدرت موراشیگه و اسکوگ حاوی 2% ساکارز (Fujifilm Wako Pure Chemical)، 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino) اتان سولفونیک اسید (MES) (Fujifilm Wako Pure C) کشت شدند. ).) و 1.5% آگار (Fujifilm Wako Pure Chemical)، pH 5.7، در دمای 23 درجه سانتی گراد و نور ثابت.بذرهای جهش یافته phs1-1 توسط T. Hashimoto (موسسه علم و فناوری نارا) تهیه شد.
بذر سویه SR-1 توسط تی هاشیموتو (موسسه علم و فناوری نارا) تهیه شد و به عنوان گیاهان تنباکوی نوع وحشی استفاده شد.دانه های تنباکو سطحی استریل شدند و به مدت سه شب در آب استریل خیس شدند تا جوانه زنی افزایش یابد، سپس در محلول نیمه قوی حاوی 2% ساکارز، 0.05% (w/v) MES و 0.8% صمغ ژلان (Fujifilm Wako Pure Chemical) قرار داده شد. موراشیگهو محیط اسکوگ) با pH 5.7 و در دمای 23 درجه سانتی گراد تحت نور ثابت انکوبه شد.
سویه Tak-1 توسط T. Kohchi (دانشگاه کیوتو) ارائه شد و به عنوان واحد آزمایشی استاندارد برای مطالعه برجک استفاده شد.جما از گیاهان کشت شده استریل شده به دست آمد و سپس روی محیط کشت گامبورگ B5 (فوجی فیلم واکو پیور شیمیایی) حاوی 1 درصد ساکارز و 3/0 درصد صمغ ژلان کشت و در دمای 23 درجه سانتی گراد زیر نور مداوم انکوبه شد.
سلول های BY-2 تنباکو (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) توسط S. Hasezawa (دانشگاه توکیو) ارائه شد.سلول های BY-2 95 برابر در محیط Linsmeier و Skoog اصلاح شده رقیق شدند و هر هفته با اسید 2،4-dichlorophenoxyacetic 32 تکمیل شدند.سوسپانسیون سلولی روی شیکر چرخشی با سرعت 130 دور در دقیقه در دمای 27 درجه سانتی گراد در تاریکی مخلوط شد.سلول ها را با حجم 10 برابر محیط تازه بشویید و مجدداً در همان محیط معلق کنید.رده های سلولی تراریخته BY-2 که نشانگر میکروتوبول TagRFP-TUA6 یا نشانگر رشته اکتین GFP-ABD2 را تحت پروموتر ویروس موزاییک گل کلم 35S به طور پایدار بیان می کنند، همانطور که توضیح داده شد، ایجاد شد.این خطوط سلولی را می‌توان با استفاده از روش‌هایی مشابه آنچه برای رده سلولی اصلی BY-2 استفاده می‌شود، حفظ و همگام‌سازی کرد.
سلول‌های HeLa در محیط Eagle اصلاح‌شده Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) همراه با 10 درصد سرم جنین گاو، 1.2 واحد بر میلی‌لیتر پنی‌سیلین و 1.2 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد با 5 درصد CO2 کشت داده شدند.
تمام آزمایشات شرح داده شده در این دست نوشته مطابق با مقررات و دستورالعمل های ایمنی زیستی ژاپن انجام شده است.
ترکیبات در دی متیل سولفوکسید (DMSO؛ Fujifilm Wako Pure Chemical) به عنوان محلول های استوک حل شده و در محیط MS برای Arabidopsis و تنباکو یا محیط Gamborg B5 برای جگر رقیق شدند.برای سنجش مهار رشد ریشه، بیش از 10 بذر در هر صفحه روی محیط کشت آگار حاوی ترکیبات مشخص شده یا DMSO کاشته شد.بذرها به مدت 7 روز در اتاقک رشد انکوبه شدند.از نهال ها عکسبرداری و طول ریشه ها اندازه گیری شد.برای سنجش جوانه زنی آرابیدوپسیس، 48 بذر در هر صفحه روی محیط کشت آگار حاوی 200 میکرومولار ترکیب یا DMSO کاشته شد.بذرهای آرابیدوپسیس در اتاقک رشد کشت شدند و تعداد نهالهای جوانه زده 7 روز پس از جوانه زنی (dag) شمارش شد.برای سنجش جوانه زنی تنباکو، 24 بذر در هر صفحه روی محیط کشت آگار حاوی 200 میکرومولار KAND یا DMSO کاشته شد.بذرهای تنباکو در اتاقک رشد کشت شدند و تعداد نهالهای جوانه زده پس از 14 روز شمارش شد.برای سنجش مهار رشد wortwort، 9 جنین از هر پلیت روی محیط آگار حاوی غلظت‌های مشخص شده KAND یا DMSO قرار گرفتند و به مدت 14 روز در یک محفظه رشد انکوبه شدند.
از نهال های رنگ آمیزی شده با 5 میلی گرم در میلی لیتر یدید پروپیدیوم (PI) برای تجسم سازمان مریستم ریشه استفاده کنید.سیگنال‌های PI توسط میکروسکوپ فلورسانس با استفاده از میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال TCS SPE (Leica Microsystems) مشاهده شد.
رنگ آمیزی هیستوشیمیایی ریشه با بتا گلوکورونیداز (GUS) طبق پروتکل توصیف شده توسط Malami و Benfey36 انجام شد.نهال ها در استون 90 درصد یک شبه تثبیت شدند، با 0.5 میلی گرم در میلی لیتر 5-بروم-4-کلرو-3-ایندولیل-β-d-گلوکورونیک اسید در بافر GUS به مدت 1 ساعت رنگ آمیزی شدند و در محلول کلرآلدئید هیدراته قرار گرفتند.(8 گرم کلرال هیدرات، 2 میلی لیتر آب و 1 میلی لیتر گلیسرول) و با میکروسکوپ کنتراست تداخل افتراقی با استفاده از میکروسکوپ Axio Imager M1 (Carl Zeiss) مشاهده شد.
زوایای ریشه روی نهال های 7 روزه رشد کرده در صفحات عمودی اندازه گیری شد.همانطور که در مرحله 6 توضیح داده شد، زاویه ریشه را از جهت بردار جاذبه اندازه گیری کنید.
چیدمان میکروتوبول های قشر مغز همانطور که توضیح داده شد، با تغییرات جزئی در پروتکل 37 مشاهده شد.آنتی بادی ضد β-توبولین (KMX-1، Merk Millipore: MAB3408) و IgG ضد موش کونژوگه با الکسا فلور 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) به عنوان آنتی بادی های اولیه و ثانویه در رقت های 1:1000 و 1:100 استفاده شد. به ترتیب.تصاویر فلورسانس با استفاده از میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال TCS SPE (Leica Microsystems) به دست آمد.تصاویر پشته Z را بدست آورید و حداکثر شدت تصویر را مطابق دستورالعمل سازنده ایجاد کنید.
سنجش تکثیر سلولی HeLa با استفاده از کیت شمارش سلولی 8 (Dojindo) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد.
رشد E. coli DH5α با اندازه گیری تراکم سلولی در کشت با استفاده از اسپکتروفتومتر در 600 نانومتر (OD600) آنالیز شد.
سازماندهی اسکلت سلولی در سلول‌های تراریخته BY-2 با استفاده از یک میکروسکوپ فلورسانس مجهز به دستگاه اسکن کانفوکال CSU-X1 (Yokogawa) و یک دوربین sCMOS (Zyla، Andor Technology) مشاهده شد.چگالی اسکلت سلولی با تجزیه و تحلیل تصویر ارزیابی شد که درصد پیکسل های اسکلت سلولی را در بین پیکسل های سیتوپلاسمی در تصاویر هم کانونی با استفاده از نرم افزار ImageJ همانطور که توضیح داده شد، کمیت کرد.
برای تشخیص مرگ سلولی در سلول‌های BY-2، مقدار کمی از سوسپانسیون سلولی با 0.05% ایوانز آبی به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.رنگ آمیزی انتخابی آبی ایوانز سلول های مرده به اکستروژن رنگ از سلول های زنده توسط غشای پلاسمایی دست نخورده بستگی دارد.سلول های رنگ آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ میدان روشن (BX53، Olympus) مشاهده شدند.
سلول های HeLa در DMEM تکمیل شده با 10٪ FBS در یک انکوباتور مرطوب در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5٪ CO2 رشد کردند.سلول ها با 100 میکرومولار KAND 11، کومامونامیک اسید 6، کومامونامید 1، 100 نانوگرم در میلی لیتر کولسمید (Gibco)، یا 100 نانوگرم در میلی لیتر نوکودماز (سیگما) به مدت 6 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد تیمار شدند.سلول ها با MetOH به مدت 10 دقیقه و سپس با استات به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند.سلول های ثابت با آنتی بادی اولیه β-توبولین (1D4A4، Proteintech: 66240-1) رقیق شده در 0.5٪ BSA/PBS به مدت 2 ساعت انکوبه شدند، 3 بار با TBST شسته شدند و سپس با آنتی بادی بز فلور الکسا انکوبه شدند.488 1 ساعت.- IgG موش (Thermo Fisher Scientific: A11001) و 15 نانوگرم در میلی لیتر 4'،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) رقیق شده در 0.5٪ BSA/PBS.پس از سه بار شستشو با TBST، سلول های رنگ آمیزی شده بر روی میکروسکوپ معکوس نیکون Eclipse Ti-E مشاهده شد.تصاویر با دوربین سرد Hamamatsu ORCA-R2 CCD با استفاده از نرم افزار MetaMorph (دستگاه های مولکولی) گرفته شد.