از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین نتیجه، توصیه می‌کنیم از نسخه جدیدتر مرورگر خود استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل یا جاوا اسکریپت نمایش می‌دهیم.
کشف و استفاده مفید از محصولات طبیعی می‌تواند به بهبود زندگی انسان کمک کند. مواد شیمیایی بازدارنده رشد گیاه به طور گسترده به عنوان علف‌کش برای کنترل علف‌های هرز استفاده می‌شوند. با توجه به نیاز به استفاده از انواع مختلف علف‌کش‌ها، نیاز به شناسایی ترکیباتی با مکانیسم‌های عمل جدید وجود دارد. در این مطالعه، ما یک ترکیب جدید N-آلکوکسی پیرول، کومامونامید، را از Streptomyces werraensis MK493-CF1 کشف کردیم و فرآیند سنتز کامل آن را ایجاد کردیم. از طریق سنجش فعالیت بیولوژیکی، ما کشف کردیم که urs-مونوآمیک اسید یک واسطه مصنوعی urs-مونوآمید و یک ترکیب بالقوه است.بازدارنده رشد گیاهعلاوه بر این، ما مشتقات مختلف اسید اوربنونیک، از جمله مشتق اوربنیلوکسی (UDA) را توسعه داده‌ایم که فعالیت علف‌کشی بالایی دارد، بدون اینکه تأثیر منفی بر رشد سلول‌های HeLa داشته باشد. ما همچنین دریافتیم که مشتقات اسید اورموتونیک، میکروتوبول‌های گیاهی را مختل می‌کنند. علاوه بر این، KAND بر رشته‌های اکتین تأثیر می‌گذارد و باعث مرگ سلولی می‌شود. این اثرات چندوجهی با اثرات مهارکننده‌های شناخته شده میکروتوبول متفاوت است و مکانیسم عمل جدیدی را برای اسید اورسونیک پیشنهاد می‌کند که نشان‌دهنده یک مزیت مهم در توسعه علف‌کش‌های جدید است.
کشف و کاربرد عملی محصولات طبیعی مفید و مشتقات آنها وسیله‌ای برای بهبود کیفیت زندگی انسان است. متابولیت‌های ثانویه تولید شده توسط میکروارگانیسم‌ها، گیاهان و حشرات منجر به پیشرفت‌های عمده‌ای در پزشکی و کشاورزی شده‌اند. بسیاری از آنتی‌بیوتیک‌ها و داروهای ضد سرطان خون از محصولات طبیعی ساخته شده‌اند. علاوه بر این، انواع مختلفی ازآفت‌کش‌هاقارچ‌کش‌ها و علف‌کش‌ها از این محصولات طبیعی برای استفاده در کشاورزی استخراج می‌شوند. به طور خاص، علف‌کش‌های کنترل علف‌های هرز ابزارهای مهمی برای افزایش عملکرد محصولات کشاورزی در کشاورزی مدرن هستند و انواع مختلفی از ترکیبات در حال حاضر به صورت تجاری مورد استفاده قرار می‌گیرند. چندین فرآیند سلولی در گیاهان، مانند فتوسنتز، متابولیسم اسید آمینه، سنتز دیواره سلولی، تنظیم میتوز، سیگنالینگ فیتوهورمون یا سنتز پروتئین، اهداف معمول علف‌کش‌ها در نظر گرفته می‌شوند. ترکیباتی که عملکرد میکروتوبول‌ها را مهار می‌کنند، دسته‌ای رایج از علف‌کش‌ها هستند که با تأثیر بر تنظیم میتوز، بر رشد گیاه تأثیر می‌گذارند.
میکروتوبول‌ها اجزای اسکلت سلولی هستند و به طور گسترده در سلول‌های یوکاریوتی حفظ شده‌اند. هترودایمر توبولین از α-توبولین و β-توبولین تشکیل شده است که پروتوفیلامنت‌های خطی میکروتوبول را تشکیل می‌دهند و 13 پروتوفیلامنت یک ساختار استوانه‌ای را تشکیل می‌دهند. میکروتوبول‌ها نقش‌های متعددی در سلول‌های گیاهی ایفا می‌کنند، از جمله تعیین شکل سلول، تقسیم سلولی و انتقال درون سلولی3،4. سلول‌های گیاهی حاوی میکروتوبول‌هایی در زیر غشای پلاسمایی اینترفازی هستند و تصور می‌شود که این میکروتوبول‌های به اصطلاح قشری، سازماندهی میکروفیبریل‌های سلولز را از طریق تنظیم کمپلکس‌های سلولز سنتاز4،5 کنترل می‌کنند. میکروتوبول‌های قشری سلول‌های اپیدرمی ریشه، که در ناحیه طویل شدن سریع نوک ریشه وجود دارند، به صورت جانبی قرار گرفته‌اند و میکروفیبرهای سلولزی از این میکروتوبول‌ها پیروی می‌کنند و جهت انبساط سلول را محدود می‌کنند و در نتیجه طویل شدن ناهمسانگرد سلول را افزایش می‌دهند. بنابراین، عملکرد میکروتوبول ارتباط نزدیکی با مورفولوژی گیاه دارد. جایگزینی اسید آمینه در ژن‌های کدکننده توبولین باعث انحراف آرایه‌های میکروتوبول قشری و رشد چپ یا راست در گیاه آرابیدوپسیس می‌شود. به طور مشابه، جهش در پروتئین‌های مرتبط با میکروتوبول که دینامیک میکروتوبول را تنظیم می‌کنند نیز می‌تواند منجر به رشد غیرطبیعی ریشه شود.8،9،10،11،12،13. علاوه بر این، تیمار با علف‌کش‌های مختل‌کننده میکروتوبول مانند دیزوپیرامید، که به عنوان پرتیلاکلر نیز شناخته می‌شود، باعث رشد مورب چپ ریشه نیز می‌شود.14. این داده‌ها نشان می‌دهند که تنظیم دقیق عملکرد میکروتوبول برای تعیین جهت رشد گیاه بسیار مهم است.
انواع مختلفی از مهارکننده‌های میکروتوبول کشف شده‌اند و این داروها سهم قابل توجهی در تحقیقات اسکلت سلولی و همچنین کشاورزی و پزشکی داشته‌اند.2 به طور خاص، اوریزالین، ترکیبات دی‌نیتروآنیلین، دیزوپیرامید، ترکیبات مرتبط با بنزامید و آنالوگ‌های آنها می‌توانند عملکرد میکروتوبول را مهار کرده و در نتیجه رشد گیاه را مهار کنند. بنابراین، آنها به طور گسترده به عنوان علف‌کش استفاده می‌شوند. با این حال، از آنجایی که میکروتوبول‌ها جزء مهمی از سلول‌های گیاهی و حیوانی هستند، اکثر مهارکننده‌های میکروتوبول برای هر دو نوع سلول سیتوتوکسیک هستند. بنابراین، علیرغم کاربرد شناخته شده آنها به عنوان علف‌کش، تعداد محدودی از عوامل ضد میکروتوبول برای اهداف عملی استفاده می‌شوند.
استرپتومایسس (Streptomyces) سرده‌ای از خانواده استرپتومایسس است که شامل باکتری‌های هوازی، گرم مثبت و رشته‌ای می‌شود و به دلیل توانایی‌اش در تولید طیف وسیعی از متابولیت‌های ثانویه، به طور گسترده شناخته شده است. بنابراین، یکی از مهمترین منابع محصولات طبیعی فعال بیولوژیکی جدید محسوب می‌شود. در مطالعه حاضر، ما یک ترکیب جدید به نام کومامونامید را کشف کردیم که از Streptomyces werraensis MK493-CF1 و S. werraensis ISP 5486 جدا شد. با استفاده از تجزیه و تحلیل طیفی و تجزیه و تحلیل طیفی کامل، ساختار کومامونامید مشخص شد و اسکلت N-آلکوکسی پیرول منحصر به فرد آن تعیین شد. سنتز. اسید اورسمونیک، یک واسطه مصنوعی از اورسمونامید و مشتقات آن، مانع رشد و جوانه‌زنی گیاه مدل محبوب Arabidopsis thaliana می‌شود. در یک مطالعه رابطه ساختار-فعالیت، ما دریافتیم که ترکیبی با C9 اصلاح‌شده به اسید اورونیک، به نام مشتق نونیلوکسی اسید اورونیک (KAND)، اثر مهاری بر رشد و جوانه‌زنی را به طور قابل توجهی افزایش می‌دهد. نکته قابل توجه این است که این مهارکننده رشد گیاه که به تازگی کشف شده است، بر رشد تنباکو و جگر سیاه نیز تأثیر می‌گذارد و برای باکتری‌ها یا سلول‌های HeLa سمیت سلولی ندارد. علاوه بر این، برخی از مشتقات اسید اورموتونیک باعث ایجاد فنوتیپ ریشه‌ای تحریف‌شده می‌شوند، که نشان می‌دهد این مشتقات به طور مستقیم یا غیرمستقیم بر میکروتوبول‌ها تأثیر می‌گذارند. مطابق با این ایده، مشاهدات ما از میکروتوبول‌های برچسب‌گذاری شده یا به صورت ایمونوهیستوشیمی یا با پروتئین‌های فلورسنت نشان می‌دهد که درمان KAND میکروتوبول‌ها را دپلیمریزه می‌کند. علاوه بر این، درمان با مشتقات اسید کوماموتونیک، ریزرشته‌های اکتین را مختل کرد. بنابراین، ما یک مهارکننده رشد گیاه جدید کشف کرده‌ایم که مکانیسم عمل منحصر به فرد آن شامل تخریب اسکلت سلولی است.
سویه MK493-CF1 از خاک در شیناگاوا-کو، توکیو جدا شد. سویه MK493-CF1 میسلیوم استرومایی با شاخه‌های فراوان تشکیل داد. توالی جزئی ژن RNA ریبوزومی 16S (1422 جفت باز) تعیین شد. این سویه بسیار شبیه به S. werraensis است (NBRC 13404T = ISP 5486، 1421/1422 جفت باز، T: سویه معمولی، 99.93٪). بر اساس این نتیجه، مشخص شد که این سویه ارتباط نزدیکی با سویه نوع S. werraensis دارد. بنابراین، ما به طور موقت این سویه را S. werraensis MK493-CF1 نامگذاری کردیم. S. werraensis ISP 5486T نیز ترکیبات زیست فعال مشابهی تولید می‌کند. از آنجایی که تحقیقات اولیه کمی در مورد به دست آوردن محصولات طبیعی از این میکروارگانیسم انجام شده است، تحقیقات شیمیایی بیشتری انجام شد. پس از کشت S. werraensis MK493-CF1 روی محیط کشت جو با تخمیر حالت جامد در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 14 روز، محیط کشت با 50٪ EtOH استخراج شد. 60 میلی لیتر از نمونه خشک شد تا 59.5 میلی گرم عصاره خام به دست آید. عصاره خام تحت HPLC فاز معکوس قرار گرفت تا N-متوکسی-1H-پیرول-2-کربوکسامید (1، به نام کومامونامید، 36.0 میلی گرم) تولید شود. مقدار کل 1 تقریباً 60٪ از عصاره خام است. بنابراین، تصمیم گرفتیم خواص کوماموتوآمید 1 را به طور مفصل مطالعه کنیم.
کومامونامید ۱ یک پودر آمورف سفید است و طیف‌سنجی جرمی با وضوح بالا (HRESIMS) وجود C6H8N2O2 را تأیید می‌کند (شکل ۱). قطعه پیرول جایگزین‌شده با C2 این ترکیب با δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4)، δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH در طیف 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) و δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) مشخص می‌شود و طیف 13C NMR وجود چهار اتم کربن sp2 را نشان می‌دهد. وجود یک گروه آمید در موقعیت C2 با همبستگی HMBC از پروتون C-3 به کربن کربونیل آمید در δC 161.1 ارزیابی شد. علاوه بر این، پیک‌های 1H و 13C NMR در δH 4.10 (3H, S) و δC 68.3 نشان‌دهنده حضور گروه‌های N-متوکسی در مولکول هستند. اگرچه موقعیت صحیح گروه متوکسی هنوز با استفاده از آنالیزهای طیف‌سنجی مانند طیف‌سنجی تفاضلی پیشرفته و اختصار هسته‌ای اورهازر (NOEDF) مشخص نشده بود، N-متوکسی-1H-پیرول-2-کربوکسامید به عنوان اولین ترکیب کاندید انتخاب شد.
برای تعیین ساختار صحیح 1، یک سنتز کامل انجام شد (شکل 2a). واکنش 2-آمینوپیریدین 2 موجود در بازار با m-CPBA منجر به تولید N-اکسید 3 مربوطه با بازده کمی شد. پس از 2-آمینوآزیداسیون 2، واکنش سیکلوکوندانساسیون شرح داده شده توسط آبراموویچ در بنزن در دمای 90 درجه سانتیگراد انجام شد تا 1-هیدروکسی-1H-پیرول-2-کربونیتریل مورد نظر 5 گرم بر حسب گرم به دست آید. سرعت 60٪ (دو مرحله). 15،16. سپس متیلاسیون و هیدرولیز 4، 1-متوکسی-1H-پیرول-2-کربوکسیلیک اسید (که "کوموتونیک اسید" نامیده می‌شود، 6) را با بازده خوب (70٪، دو مرحله) تولید کرد. در نهایت، آمیداسیون از طریق واسطه اسید کلرید 6 با استفاده از آمونیاک آبی، کوماموتو آمید 1 را با بازده 98٪ تولید کرد. تمام داده‌های طیفی 1 سنتز شده مشابه 1 جدا شده بود، بنابراین ساختار 1 تعیین شد.
سنتز و تجزیه و تحلیل کلی فعالیت بیولوژیکی اوربنامید و اوربنیک اسید. (الف) سنتز کامل کوماموتو آمید. (ب) نهال‌های هفت روزه آرابیدوپسیس کلمبیا (Col) از نوع وحشی روی پلیت‌های موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی کومامونامید 6 یا کومامونامید 1 در غلظت‌های مشخص شده کشت داده شدند. مقیاس = 1 سانتی‌متر.
ابتدا، فعالیت‌های بیولوژیکی اوربنامید و واسطه‌های آن را از نظر توانایی آنها در تعدیل رشد گیاه ارزیابی کردیم. غلظت‌های مختلفی از اورسنامید ۱ یا اورسنیک اسید ۶ را به محیط کشت MS آگار اضافه کردیم و نهال‌های آرابیدوپسیس تالیانا را روی این محیط کشت کشت دادیم. این سنجش‌ها نشان داد که غلظت‌های بالای (۵۰۰ میکرومولار) از ۶، رشد ریشه را مهار می‌کند (شکل ۲ب). در مرحله بعد، با جایگزینی موقعیت N1 از ۶، مشتقات مختلفی تولید کردیم و مطالعات رابطه ساختار-فعالیت را روی آنها انجام دادیم (فرآیند سنتز آنالوگ در اطلاعات تکمیلی (SI) شرح داده شده است). نهال‌های آرابیدوپسیس روی محیطی حاوی ۵۰ میکرومولار مشتقات اورسنیک اسید رشد داده شدند و طول ریشه اندازه‌گیری شد، همانطور که در تصویر نشان داده شده است. همانطور که در شکل‌های 3a، b و S1 نشان داده شده است، اسیدهای کوآمی در موقعیت N1 دارای طول‌های مختلفی از زنجیره‌های آلکوکسی خطی (9، 10، 11، 12 و 13) یا زنجیره‌های آلکوکسی بزرگ (15، 16 و 17) هستند. مشتقات، مهار قابل توجهی از رشد ریشه نشان دادند. علاوه بر این، ما دریافتیم که کاربرد 200 میکرومولار 10، 11 یا 17 جوانه‌زنی را مهار می‌کند (شکل‌های 3c و S2).
مطالعه رابطه ساختار-فعالیت کوماموتو آمید و ترکیبات مرتبط. (الف) ساختار و طرح سنتز آنالوگ‌ها. (ب) تعیین کمی طول ریشه گیاهچه‌های ۷ روزه رشد یافته در محیط کشت MS با یا بدون ۵۰ میکرومولار مشتقات کومامونامید. ستاره‌ها نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار با تیمار شم هستند (آزمون t، p<0.05).n>۱۸. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده‌اند. nt به معنی «آزمایش نشده» است زیرا بیش از ۵۰٪ از بذرها جوانه نزدند. (ج) تعیین کمی سرعت جوانه‌زنی بذرهای تیمار شده که به مدت ۷ روز در محیط کشت MS با یا بدون ۲۰۰ میکرومولار کومامونامید و ترکیبات مرتبط انکوبه شده‌اند. ستاره‌ها نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار با تیمار شم هستند (آزمون کای‌اسکوئر). n=۹۶.
جالب توجه است که افزودن زنجیره‌های جانبی آلکیل بلندتر از C9، فعالیت مهاری را کاهش داد، که نشان می‌دهد ترکیبات مرتبط با اسید کوماموتوئیک برای نشان دادن فعالیت بیولوژیکی خود به زنجیره‌های جانبی با اندازه مشخص نیاز دارند.
از آنجا که تجزیه و تحلیل رابطه ساختار-فعالیت نشان داد که C9 به اسید اورونیک تغییر یافته و مشتق نانیلوکسی اسید اورونیک (که از این پس KAND 11 نامیده می‌شود) مؤثرترین مهارکننده رشد گیاه است، ما توصیف دقیق‌تری از KAND 11 انجام دادیم. تیمار آرابیدوپسیس با 50 میکرومولار KAND 11 تقریباً به طور کامل از جوانه‌زنی جلوگیری کرد، در حالی که غلظت‌های پایین‌تر (40، 30، 20 یا 10 میکرومولار) KAND 11 رشد ریشه را به صورت وابسته به دوز مهار کرد (شکل 4a، b). برای آزمایش اینکه آیا KAND 11 بر زنده‌مانی مریستم ریشه تأثیر می‌گذارد، مریستم‌های ریشه رنگ‌آمیزی شده با پروپیدیوم یدید (PI) را بررسی و اندازه ناحیه مریستم را اندازه‌گیری کردیم. اندازه مریستم گیاهچه‌های رشد یافته در محیط کشت حاوی 25 میکرومولار KAND-11، 151.1 ± 32.5 میکرومتر بود، در حالی که اندازه مریستم گیاهچه‌های رشد یافته در محیط کشت کنترل حاوی DMSO، 264.7 ± 30.8 میکرومتر بود (شکل 4c، d)، که نشان می‌دهد KAND-11 فعالیت سلولی را بازیابی می‌کند. گسترش. مریستم ریشه. مطابق با این، تیمار KAND 11 میزان سیگنال نشانگر تقسیم سلولی CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS را در مریستم ریشه کاهش داد (شکل 4e) 17. این نتایج نشان می‌دهد که KAND 11 با کاهش فعالیت تکثیر سلولی، رشد ریشه را مهار می‌کند.
تجزیه و تحلیل اثر بازدارندگی مشتقات اسید اوربنونیک (مشتقات اوربنیلوکسی) بر رشد. (الف) نهال‌های 7 روزه وحشی Col که در صفحات MS با غلظت‌های مشخص شده KAND 11 رشد کرده‌اند. نوار مقیاس = 1 سانتی‌متر. (ب) اندازه‌گیری کمی طول ریشه. حروف نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار هستند (آزمون Tukey HSD، p<0.05).n>16. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده‌اند. (ج) میکروسکوپ کانفوکال از ریشه‌های Col وحشی رنگ‌آمیزی شده با پروپیدیوم یدید که در صفحات MS با یا بدون 25 میکرومولار KAND 11 رشد کرده‌اند. براکت‌های سفید نشان دهنده مریستم ریشه هستند. نوار مقیاس = 100 میکرومتر. (د) تعیین کمی اندازه مریستم ریشه (n = 10 تا 11). تفاوت‌های آماری با استفاده از آزمون t تعیین شدند (p< 0.05). میله‌ها نشان دهنده میانگین اندازه مریستم هستند. (ه) میکروسکوپ کنتراست تداخل افتراقی (DIC) از مریستم ریشه حاوی سازه CDKB2؛ 1pro: CDKB2؛ 1-GUS رنگ‌آمیزی شده و روی گیاهچه‌های 5 روزه رشد یافته در صفحات MS با یا بدون سنجش KAND 25 میکرومولار رنگ‌آمیزی شده است.
سمیت گیاهی KAND 11 با استفاده از یک گیاه دو لپه‌ای دیگر، تنباکو (Nicotiana tabacum) و یک ارگانیسم مدل گیاهی اصلی خشکی، لیور ورت (Marchantia polymorpha) بیشتر آزمایش شد. همانند مورد آرابیدوپسیس، نهال‌های تنباکو SR-1 که در محیط کشت حاوی 25 میکرومولار KAND 11 رشد کرده بودند، ریشه‌های کوتاه‌تری تولید کردند (شکل 5a). علاوه بر این، 40 عدد از 48 بذر در پلیت‌های حاوی 200 میکرومولار KAND 11 جوانه زدند، در حالی که هر 48 بذر در محیط‌های کشت آزمایشی جوانه زدند، که نشان می‌دهد غلظت‌های بالاتر KAND قابل توجه بوده‌اند (p< 0.05؛ آزمون کای دو) جوانه زنی تنباکو را مهار کرد. (شکل 5b). علاوه بر این، غلظت KAND 11 که رشد باکتری را در گیاه جگرخوار مهار کرد، مشابه غلظت مؤثر در گیاه آرابیدوپسیس بود (شکل 5c). این نتایج نشان می‌دهد که KAND 11 می‌تواند رشد انواع گیاهان را مهار کند. سپس سمیت سلولی احتمالی ترکیبات مرتبط با مونوآمید خرس را در سایر موجودات زنده، یعنی سلول‌های HeLa انسانی و سویه DH5α اشریشیا کلی، به ترتیب به عنوان نمایندگان سلول‌های حیوانی و باکتریایی عالی، بررسی کردیم. در یک سری از سنجش‌های تکثیر سلولی، مشاهده کردیم که کومامونامید 1، کومامونامیدیک اسید 6 و KAND 11 در غلظت‌های 100 میکرومولار بر رشد سلول‌های HeLa یا E. coli تأثیری نداشتند (شکل 5d، e).
مهار رشد KAND 11 در موجودات غیر آرابیدوپسیس. (الف) نهال‌های توتون وحشی SR-1 دو هفته‌ای روی صفحات MS عمودی حاوی 25 میکرومولار KAND 11 کشت داده شدند. (ب) نهال‌های توتون وحشی SR-1 دو هفته‌ای روی صفحات MS افقی حاوی 200 میکرومولار KAND 11 کشت داده شدند. (ج) جوانه‌های دو هفته‌ای Tak-1 وحشی لیورورت کشت داده شده روی صفحات Gamborg B5 با غلظت‌های مشخص شده KAND 11. فلش‌های قرمز نشان دهنده اسپورهایی هستند که رشد آنها در دوره انکوباسیون دو هفته‌ای متوقف شد. (د) سنجش تکثیر سلولی سلول‌های HeLa. تعداد سلول‌های زنده در فواصل زمانی ثابت با استفاده از کیت شمارش سلولی 8 (Dojindo) اندازه‌گیری شد. به عنوان کنترل، سلول‌های HeLa با 5 میکروگرم در میلی‌لیتر اکتینومایسین D (Act D) تیمار شدند که رونویسی RNA پلیمراز را مهار می‌کند و باعث مرگ سلولی می‌شود. تجزیه و تحلیل‌ها در سه تکرار انجام شد. (ه) سنجش تکثیر سلولی E. coli. رشد E. coli با اندازه‌گیری OD600 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. به عنوان کنترل، سلول‌ها با 50 میکروگرم در میلی‌لیتر آمپی‌سیلین (Amp) که سنتز دیواره سلولی باکتری را مهار می‌کند، تیمار شدند. تجزیه و تحلیل‌ها در سه تکرار انجام شد.
برای رمزگشایی مکانیسم اثر سمیت سلولی ناشی از ترکیبات مرتبط با اورامید، مشتقات اسید اوربنیک با اثرات مهاری متوسط را مجدداً تجزیه و تحلیل کردیم، همانطور که در تصویر نشان داده شده است. همانطور که در شکل‌های 2b و 6a نشان داده شده است، نهال‌های رشد یافته روی صفحات آگار حاوی غلظت‌های بالا (200 میکرومولار) اسید اورموتونیک 6، ریشه‌های کوتاه‌تر و چپ‌خم (θ = -23.7 ± 6.1) تولید کردند، در حالی که نهال‌های رشد یافته در محیط کنترل، ریشه‌های تقریباً مستقیمی تولید کردند (θ = -3.8 ± 7.1). این رشد مورب مشخصه، ناشی از اختلال عملکرد میکروتوبول‌های قشری است14،18. مطابق با این یافته، داروهای بی‌ثبات‌کننده میکروتوبول، دیزوپیرامید و اوریزالین، کج شدن ریشه مشابهی را در شرایط رشد ما القا کردند (شکل‌های 2b و 6a). در همان زمان، ما مشتقات اسید اورموتونیک را آزمایش کردیم و چندین مورد از آنها را انتخاب کردیم که در غلظت‌های خاص، رشد ریشه مورب را القا کردند. ترکیبات ۸، ۹ و ۱۵ به ترتیب در غلظت‌های ۷۵ میکرومولار، ۵۰ میکرومولار و ۴۰ میکرومولار جهت رشد ریشه را تغییر دادند که نشان می‌دهد این ترکیبات می‌توانند به طور مؤثر میکروتوبول‌ها را بی‌ثبات کنند (شکل ۲b، ۶a). ما همچنین قوی‌ترین مشتق اسید اورسولیک، KAND 11، را در غلظت پایین‌تر (۱۵ میکرومولار) آزمایش کردیم و دریافتیم که استفاده از KAND 11 رشد ریشه را مهار می‌کند و جهت رشد ریشه ناهموار است، اگرچه تمایل به شیب به سمت چپ دارند (شکل C3). از آنجا که غلظت‌های بالاتر داروهای بی‌ثبات‌کننده میکروتوبول گاهی اوقات به جای کج شدن ریشه، رشد گیاه را مهار می‌کنند، متعاقباً با مشاهده میکروتوبول‌های قشری در سلول‌های اپیدرمی ریشه، احتمال تأثیر KAND 11 بر میکروتوبول‌ها را ارزیابی کردیم. ایمونوهیستوشیمی با استفاده از آنتی‌بادی‌های ضد بتا-توبولین در سلول‌های اپیدرمی ریشه‌های گیاهچه تیمار شده با 25 میکرومولار KAND 11، ناپدید شدن تقریباً تمام میکروتوبول‌های قشری در سلول‌های اپیدرمی در ناحیه طویل شدن را نشان داد (شکل 6b). این نتایج نشان می‌دهد که اسید کوماموتونیک و مشتقات آن به طور مستقیم یا غیرمستقیم بر روی میکروتوبول‌ها عمل می‌کنند تا آنها را مختل کنند و این ترکیبات مهارکننده‌های جدید میکروتوبول هستند.
اسید اورسونیک و مشتقات آن، میکروتوبول‌های قشری را در گیاه آرابیدوپسیس تالیانا تغییر می‌دهند. (الف) زاویه شیب ریشه در حضور مشتقات مختلف اسید اورموتونیک در غلظت‌های مشخص شده اندازه‌گیری شده است. اثرات دو ترکیب شناخته شده برای مهار میکروتوبول‌ها: دیزوپیرامید و اوریزالین نیز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تصویر داخل کادر، استاندارد مورد استفاده برای اندازه‌گیری زاویه رشد ریشه را نشان می‌دهد. ستاره‌ها نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار با تیمار ساختگی هستند (آزمون t، p<0.05).n>19. نوار مقیاس = 1 سانتی‌متر. (ب) میکروتوبول‌های قشری در سلول‌های اپیدرمی در ناحیه طویل شدن. میکروتوبول‌ها در ریشه‌های Col آرابیدوپسیس وحشی رشد یافته در صفحات MS با یا بدون 25 میکرومولار KAND 11 با رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی با استفاده از آنتی‌بادی‌های اولیه β-توبولین و آنتی‌بادی‌های ثانویه کونژوگه شده با Alexa Fluor مشاهده شدند. نوار مقیاس = 10 میکرومتر. (ج) ساختار میتوزی میکروتوبول‌ها در مریستم ریشه. میکروتوبول‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی مشاهده شدند. ساختارهای میتوزی، شامل نواحی پروفاز، دوک‌ها و فراگموپلاست‌ها، از تصاویر کانفوکال شمارش شدند. فلش‌ها ساختارهای میکروتوبول میتوزی را نشان می‌دهند. ستاره‌ها تفاوت‌های معنی‌دار با تیمار شم را نشان می‌دهند (آزمون t، p<0.05).n>۹. نوار مقیاس = ۵۰ میکرومتر.
اگرچه اورسا توانایی اختلال در عملکرد میکروتوبول‌ها را دارد، اما انتظار می‌رود مکانیسم عمل آن با عوامل معمول دپلیمریزاسیون میکروتوبول متفاوت باشد. به عنوان مثال، غلظت‌های بالاتر عوامل دپلیمریزاسیون میکروتوبول مانند دیزوپیرامید و اوریزالین باعث گسترش ناهمسانگرد سلول‌های اپیدرمی می‌شوند، در حالی که KAND 11 این کار را نمی‌کند. علاوه بر این، استفاده همزمان از KAND 11 و دیزوپیرامید منجر به پاسخ ترکیبی رشد ریشه القا شده توسط دیزوپیرامید شد و مهار رشد القا شده توسط KAND 11 مشاهده شد (شکل S4). ما همچنین پاسخ جهش یافته دیزوپیرامید 1-1 (phs1-1) فوق حساس به KAND 11 را تجزیه و تحلیل کردیم. phs1-1 دارای جهش نقطه‌ای توبولین کیناز غیر متعارف است و هنگام تیمار با دیزوپیرامید9،20 ریشه‌های کوتاه‌تری تولید می‌کند. نهال‌های جهش یافته phs1-1 که در محیط آگار حاوی KAND 11 رشد کردند، ریشه‌های کوتاه‌تری مشابه ریشه‌های رشد یافته روی دیزوپیرامید داشتند (شکل S5).
علاوه بر این، ما ساختارهای میکروتوبول میتوزی، مانند مناطق پروفاز، دوک‌ها و فراگموپلاست‌ها را در مریستم ریشه گیاهچه‌های تیمار شده با KAND 11 مشاهده کردیم. مطابق با مشاهدات مربوط به CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS، کاهش قابل توجهی در تعداد میکروتوبول‌های میتوزی مشاهده شد (شکل 6c).
برای مشخص کردن سمیت سلولی KAND 11 در تفکیک زیر سلولی، سلول‌های سوسپانسیون BY-2 توتون را با KAND 11 تیمار کردیم و پاسخ آنها را مشاهده کردیم. ابتدا KAND 11 را به سلول‌های BY-2 بیان‌کننده TagRFP-TUA6 که میکروتوبول‌ها را به صورت فلورسنت برچسب‌گذاری می‌کند، اضافه کردیم تا اثر KAND 11 را بر میکروتوبول‌های قشر مغز ارزیابی کنیم. تراکم میکروتوبول‌های قشر مغز با استفاده از آنالیز تصویر ارزیابی شد که درصد پیکسل‌های اسکلت سلولی را در بین پیکسل‌های سیتوپلاسمی اندازه‌گیری می‌کرد. نتایج سنجش نشان داد که پس از تیمار با 50 میکرومولار یا 100 میکرومولار KAND 11 به مدت 1 ساعت، تراکم به طور قابل توجهی به ترتیب به 0.94 ± 0.74٪ یا 0.23 ± 0.28٪ کاهش یافت، در حالی که تراکم سلول‌های تیمار شده با DMSO به 1.61 ± 0.34٪ رسید (شکل 7a). این نتایج با مشاهده در Arabidopsis مطابقت دارد که تیمار KAND 11 باعث دپلیمریزاسیون میکروتوبول‌های قشری می‌شود (شکل 6b). ما همچنین رده BY-2 را با رشته‌های اکتین نشاندار شده با GFP-ABD پس از تیمار با همان غلظت KAND 11 بررسی کردیم و مشاهده کردیم که تیمار KAND 11 رشته‌های اکتین را مختل می‌کند. تیمار با 50 میکرومولار یا 100 میکرومولار KAND 11 به مدت 1 ساعت، چگالی رشته‌های اکتین را به ترتیب به 1.20 ± 0.62٪ یا 0.61 ± 0.26٪ کاهش داد، در حالی که چگالی در سلول‌های تیمار شده با DMSO 1.69 ± 0.51٪ بود (شکل 2). 7b). این نتایج با اثرات پروپیزامید که بر رشته‌های اکتین تأثیری ندارد و لاترنکولین B، یک دپلیمریزه‌کننده اکتین که بر میکروتوبول‌ها تأثیری ندارد (شکل SI S6)، در تضاد است. علاوه بر این، درمان با کومامونامید ۱، کومامونامید اسید ۶ یا KAND 11 بر میکروتوبول‌ها در سلول‌های HeLa تأثیری نداشت (شکل SI S7). بنابراین، اعتقاد بر این است که مکانیسم عمل KAND 11 با مکانیسم عمل مختل‌کننده‌های شناخته‌شده اسکلت سلولی متفاوت است. علاوه بر این، مشاهده میکروسکوپی ما از سلول‌های BY-2 تحت درمان با KAND 11، شروع مرگ سلولی را در طول درمان با KAND 11 نشان داد و نشان داد که نسبت سلول‌های مرده رنگ‌آمیزی شده با رنگ آبی ایوانز پس از 30 دقیقه درمان با KAND 11 افزایش معنی‌داری نداشت، در حالی که پس از 90 دقیقه درمان با 50 میکرومولار یا 100 میکرومولار KAND، تعداد سلول‌های مرده به ترتیب به 43.7٪ یا 80.1٪ افزایش یافت (شکل 7c). روی هم رفته، این داده‌ها نشان می‌دهند که مشتق جدید اسید اورسولیک KAND 11 یک مهارکننده اسکلت سلولی مخصوص گیاه با مکانیسم عمل قبلاً ناشناخته است.
KAND بر میکروتوبول‌های قشری، رشته‌های اکتین و زیست‌پذیری سلول‌های BY-2 تنباکو تأثیر می‌گذارد. (الف) تجسم میکروتوبول‌های قشری در سلول‌های BY-2 در حضور TagRFP-TUA6. سلول‌های BY-2 تیمار شده با KAND 11 (50 میکرومولار یا 100 میکرومولار) یا DMSO با میکروسکوپ کانفوکال بررسی شدند. تراکم میکروتوبول‌های قشری از روی تصاویر میکروسکوپی 25 سلول مستقل محاسبه شد. حروف نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار هستند (آزمون Tukey HSD، p< 0.05). نوار مقیاس = 10 میکرومتر. (ب) رشته‌های اکتین قشری در سلول‌های BY-2 که در حضور GFP-ABD2 مشاهده شده‌اند. سلول‌های BY-2 تیمار شده با KAND 11 (50 میکرومولار یا 100 میکرومولار) یا DMSO با میکروسکوپ کانفوکال بررسی شدند. چگالی رشته‌های اکتین قشری از روی تصاویر میکروسکوپی 25 سلول مستقل محاسبه شد. حروف نشان‌دهنده تفاوت‌های معنی‌دار هستند (آزمون Tukey HSD، p< 0.05). نوار مقیاس = 10 میکرومتر. (ج) مشاهده سلول‌های مرده BY-2 با رنگ‌آمیزی آبی ایوانز. سلول‌های BY-2 تیمار شده با KAND 11 (50 میکرومولار یا 100 میکرومولار) یا DMSO با میکروسکوپ میدان روشن بررسی شدند. n=3. نوار مقیاس = 100 میکرومتر.
کشف و کاربرد محصولات طبیعی جدید منجر به پیشرفت‌های چشمگیری در جنبه‌های مختلف زندگی انسان، از جمله پزشکی و کشاورزی شده است. تحقیقات تاریخی برای به دست آوردن ترکیبات مفید از منابع طبیعی انجام شده است. به طور خاص، اکتینومیست‌ها به دلیل توانایی‌شان در تولید متابولیت‌های ثانویه مختلف مانند آورمکتین، ترکیب اصلی ایورمکتین و بلئومایسین و مشتقات آن، که به عنوان یک عامل ضد سرطان در پزشکی استفاده می‌شوند، به عنوان آنتی‌بیوتیک‌های ضد انگلی برای نماتدها مفید شناخته شده‌اند21،22. به همین ترتیب، ترکیبات علف‌کش متنوعی از اکتینومیست‌ها کشف شده‌اند که برخی از آنها قبلاً به صورت تجاری استفاده می‌شوند1،23. بنابراین، تجزیه و تحلیل متابولیت‌های اکتینومیست برای جداسازی محصولات طبیعی با فعالیت‌های بیولوژیکی مطلوب، یک استراتژی مؤثر در نظر گرفته می‌شود. در این مطالعه، ما یک ترکیب جدید، کومامونامید، را از S. werraensis کشف و با موفقیت آن را سنتز کردیم. اسید اورسونیک یک واسطه مصنوعی از اوربنامید و مشتقات آن است. این ماده می‌تواند باعث پیچ خوردگی ریشه شود، فعالیت علف‌کشی متوسط تا قوی از خود نشان دهد و به طور مستقیم یا غیرمستقیم به میکروتوبول‌های گیاهی آسیب برساند. با این حال، مکانیسم عمل اسید اورموتونیک ممکن است با مهارکننده‌های میکروتوبول موجود متفاوت باشد، زیرا KAND 11 همچنین رشته‌های اکتین را مختل کرده و باعث مرگ سلولی می‌شود، که نشان دهنده یک مکانیسم تنظیمی است که از طریق آن اسید اورموتونیک و مشتقات آن بر طیف وسیعی از ساختارهای اسکلت سلولی تأثیر می‌گذارند.
توصیف دقیق‌تر اسید اوربنونیک به درک بهتر مکانیسم عمل اسید اوربنونیک کمک خواهد کرد. به طور خاص، هدف بعدی ارزیابی توانایی اسید اورسونیک در اتصال به میکروتوبول‌های کاهش‌یافته است تا مشخص شود که آیا اسید اورسونیک و مشتقات آن مستقیماً بر روی میکروتوبول‌ها عمل کرده و آنها را دپلیمریزه می‌کنند یا اینکه عملکرد آنها منجر به بی‌ثباتی میکروتوبول‌ها می‌شود. علاوه بر این، در مواردی که میکروتوبول‌ها هدف مستقیمی نیستند، شناسایی محل عمل و اهداف مولکولی اسید اورسونیک بر روی سلول‌های گیاهی به درک بیشتر خواص ترکیبات مرتبط و راه‌های ممکن برای بهبود فعالیت علف‌کشی کمک خواهد کرد. سنجش فعالیت زیستی ما توانایی منحصر به فرد سیتوتوکسیک اسید اورسونیک بر رشد گیاهانی مانند Arabidopsis thaliana، تنباکو و liverwort را نشان داد، در حالی که نه سلول‌های E. coli و نه HeLa تحت تأثیر قرار نگرفتند. سمیت کم یا عدم سمیت برای سلول‌های حیوانی، مزیت مشتقات اسید اورسونیک است اگر به عنوان علف‌کش برای استفاده در مزارع کشاورزی آزاد توسعه داده شوند. در واقع، از آنجایی که میکروتوبول‌ها ساختارهای رایجی در یوکاریوت‌ها هستند، مهار انتخابی آنها در گیاهان یک الزام کلیدی برای علف‌کش‌ها است. به عنوان مثال، پروپیزامید، یک عامل دپلیمریزه کننده میکروتوبول که مستقیماً به توبولین متصل می‌شود و پلیمریزاسیون را مهار می‌کند، به دلیل سمیت کم آن برای سلول‌های حیوانی به عنوان علف‌کش استفاده می‌شود24. در مقایسه با دیزوپیرامید، بنزامیدهای مرتبط دارای ویژگی‌های هدف متفاوتی هستند. علاوه بر میکروتوبول‌های گیاهی، RH-4032 یا بنزوکسامید به ترتیب میکروتوبول‌های سلول‌های حیوانی یا اوومیست‌ها را نیز مهار می‌کند و زالیلامید به دلیل سمیت گیاهی کم آن به عنوان قارچ‌کش استفاده می‌شود25،26،27. خرس تازه کشف شده و مشتقات آن سمیت سلولی انتخابی را در برابر گیاهان نشان می‌دهند، اما شایان ذکر است که اصلاحات بیشتر ممکن است ویژگی هدف آنها را تغییر دهد و به طور بالقوه مشتقات بیشتری را برای کنترل قارچ‌های بیماری‌زا یا اوومیست‌ها فراهم کند.
خواص منحصر به فرد اسید اوربنونیک و مشتقات آن برای توسعه آنها به عنوان علف‌کش و استفاده به عنوان ابزار تحقیقاتی مفید است. اهمیت اسکلت سلولی در کنترل شکل سلول‌های گیاهی به طور گسترده شناخته شده است. مطالعات قبلی نشان داده است که گیاهان مکانیسم‌های پیچیده‌ای از سازماندهی میکروتوبول‌های قشری را با کنترل دینامیک میکروتوبول‌ها برای کنترل صحیح مورفوژنز تکامل داده‌اند. تعداد زیادی از مولکول‌های مسئول تنظیم فعالیت میکروتوبول شناسایی شده‌اند و تحقیقات مرتبط هنوز در حال انجام است3،4،28. درک فعلی ما از دینامیک میکروتوبول‌ها در سلول‌های گیاهی مکانیسم‌های سازماندهی میکروتوبول‌های قشری را به طور کامل توضیح نمی‌دهد. به عنوان مثال، اگرچه هم دیزوپیرامید و هم اوریزالین می‌توانند میکروتوبول‌ها را دپلیمریزه کنند، دیزوپیرامید باعث تغییر شکل شدید ریشه می‌شود در حالی که اوریزالین اثر نسبتاً خفیفی دارد. علاوه بر این، جهش در توبولین، که میکروتوبول‌ها را تثبیت می‌کند، باعث چرخش راستگرد در ریشه‌ها نیز می‌شود، در حالی که پاکلیتاکسل، که دینامیک میکروتوبول‌ها را نیز تثبیت می‌کند، این کار را نمی‌کند. بنابراین، مطالعه و شناسایی اهداف مولکولی اسید اورسولیک باید بینش‌های جدیدی در مورد تنظیم میکروتوبول‌های قشری گیاه ارائه دهد. به همین ترتیب، مقایسه‌های آینده مواد شیمیایی مؤثر در افزایش رشد غیرطبیعی، مانند دیزوپیرامید، و مواد شیمیایی کم‌اثرتر، مانند اریزالین یا اسید کوماموتریک، سرنخ‌هایی در مورد چگونگی وقوع رشد غیرطبیعی ارائه خواهد داد.
از سوی دیگر، بازآرایی‌های اسکلت سلولی مرتبط با دفاع، احتمال دیگری برای توضیح سمیت سلولی اسید اورسونیک هستند. عفونت یک پاتوژن یا ورود یک الیسیتور به سلول‌های گیاهی گاهی اوقات باعث تخریب اسکلت سلولی و مرگ سلولی متعاقب آن می‌شود29. به عنوان مثال، گزارش شده است که کریپتوگزانتین مشتق شده از اوومیست، قبل از مرگ سلول‌های تنباکو، میکروتوبول‌ها و رشته‌های اکتین را مختل می‌کند، مشابه آنچه در تیمار KAND رخ می‌دهد30،31. شباهت‌های بین پاسخ‌های دفاعی و پاسخ‌های سلولی ناشی از اسید اورسونیک ما را به این فرضیه سوق داد که آنها فرآیندهای سلولی مشترکی را تحریک می‌کنند، اگرچه اثر سریع‌تر و قوی‌تر اسید اورسونیک نسبت به کریپتوگزانتین مشهود است. با این حال، مطالعات نشان داده‌اند که اختلال در رشته‌های اکتین باعث مرگ خود به خودی سلول می‌شود، که همیشه با اختلال در میکروتوبول‌ها همراه نیست29. علاوه بر این، هنوز مشخص نیست که آیا پاتوژن یا الیسیتور باعث رشد غیرطبیعی ریشه می‌شوند، همانطور که مشتقات اسید اورسونیک این کار را انجام می‌دهند. بنابراین، دانش مولکولی که پاسخ‌های دفاعی و اسکلت سلولی را به هم مرتبط می‌کند، یک مسئله جذاب برای بررسی است. با بهره‌گیری از وجود ترکیبات با وزن مولکولی کم مرتبط با اسید اورسونیک، و همچنین طیف وسیعی از مشتقات با قدرت‌های مختلف، آنها ممکن است فرصت‌هایی را برای هدف قرار دادن مکانیسم‌های سلولی ناشناخته فراهم کنند.
روی هم رفته، کشف و کاربرد ترکیبات جدیدی که دینامیک میکروتوبول‌ها را تعدیل می‌کنند، روش‌های قدرتمندی را برای پرداختن به مکانیسم‌های مولکولی پیچیده‌ی زیربنایی تعیین شکل سلول‌های گیاهی فراهم می‌کند. در این زمینه، ترکیب اخیراً توسعه‌یافته‌ی اسید اورموتونیک، که بر میکروتوبول‌ها و رشته‌های اکتین تأثیر می‌گذارد و باعث مرگ سلولی می‌شود، ممکن است فرصتی را برای رمزگشایی ارتباط بین کنترل میکروتوبول‌ها و این مکانیسم‌های دیگر فراهم کند. بنابراین، تجزیه و تحلیل شیمیایی و بیولوژیکی با استفاده از اسید اوربنونیک به ما در درک مکانیسم‌های تنظیمی مولکولی که اسکلت سلولی گیاه را کنترل می‌کنند، کمک خواهد کرد.
S. werraensis MK493-CF1 را در یک ارلن مایر بافل‌دار ۵۰۰ میلی‌لیتری حاوی ۱۱۰ میلی‌لیتر محیط کشت بذر شامل ۲٪ (وزنی/حجمی) گالاکتوز، ۲٪ (وزنی/حجمی) خمیر اسانس، ۱٪ (وزنی/حجمی) ترکیب باکتو-سوئیتون (شرکت Thermo Fisher Scientific, Inc.)، ۰.۵٪ (وزنی/حجمی) عصاره ذرت (شرکت KOGOSTCH، Ltd.، ژاپن)، ۰.۲٪ (وزنی/حجمی) (NH4)2SO4 و ۰.۲٪ CaCO3 در آب دیونیزه (pH 7.4 قبل از استریلیزاسیون) تلقیح کنید. کشت‌های بذر به مدت ۲ روز روی شیکر چرخشی (۱۸۰ دور در دقیقه) در دمای ۲۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند. کشت تولید از طریق تخمیر حالت جامد. کشت بذر (7 میلی‌لیتر) به یک فلاسک 500 میلی‌لیتری K-1 حاوی 40 گرم محیط کشت تولیدی شامل 15 گرم جو فشرده (شرکت MUSO، محدود، ژاپن) و 25 گرم آب دیونیزه (pH قبل از استریلیزاسیون تنظیم نشده بود) منتقل شد. تخمیر به مدت 14 روز در دمای 30 درجه سانتیگراد در تاریکی انجام شد. مواد تخمیر با 40 میلی‌لیتر در هر بطری EtOH استخراج و سانتریفیوژ شدند (1500 گرم، 4 درجه سانتیگراد، 10 دقیقه). مایع رویی کشت (60 میلی‌لیتر) با مخلوطی از 10٪ MeOH/EtOAc استخراج شد. لایه آلی تحت فشار کاهش‌یافته تبخیر شد تا باقیمانده‌ای (۵۹.۵ میلی‌گرم) به دست آید که در معرض HPLC با شویش گرادیان (۰-۱۰ دقیقه: ۹۰٪) روی ستون فاز معکوس (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120، ۵ میکرومتر، قطر داخلی ۱۰ میلی‌متر × طول ۲۵۰ میلی‌متر) H2O/CH3CN، ۱۰-۳۵ دقیقه: ۹۰٪ H2O/CH3CN به ۷۰٪ H2O/CH3CN (گرادیان)، ۳۵-۴۵ دقیقه: ۹۰٪ H2O/EtOH، ۴۵-۱۵۵ دقیقه: ۹۰٪ H2O/EtOH به ۱۰۰٪ EtOH (گرادیان (گرادیان)، ۱۵۵-۲۰۰ دقیقه: ۱۰۰٪ EtOH) با سرعت جریان ۱.۵ میلی‌لیتر در دقیقه قرار گرفت، کومامونامید (۱، ۳۶.۰ میلی‌گرم) به صورت پودر آمورف سفید جدا شد.
کوماموتوآمید(1)؛ 1H-NMR (500 مگاهرتز، CDCl3) δ 6.93 (t، J = 2.5 هرتز، 1H)، 6.76 (dd، J = 4.3، 1.8 هرتز 1H)، 6.05 (t، J = 3.8 هرتز، 1H).)، 4.08 (s، 3H)؛ 13C-NMR (125 مگاهرتز، CDCl3) δ 161.1، 121.0، 119.9، 112.2، 105.0، 68.3؛ ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ مقدار محاسبه‌شده: ۱۴۱.۰۶۵۹، مقدار اندازه‌گیری‌شده: ۱۴۱.۰۶۶۳، IR νmax ۳۴۵۱، ۳۴۱۴، ۳۱۷۳، ۲۹۳۸، ۱۶۰۳، ۱۵۹۳، ۱۵۳۷ cm-۱.
بذرهای گیاه کلمبیا (Col-0) با اجازه استفاده تحقیقاتی از مرکز منابع بیولوژیکی آرابیدوپسیس (ABRC) تهیه شدند. بذرهای Col-0 تحت شرایط آزمایشگاهی ما تکثیر و نگهداری شدند و به عنوان گیاهان آرابیدوپسیس وحشی مورد استفاده قرار گرفتند. بذرهای آرابیدوپسیس استریل سطحی شده و در محیط کشت Murashige and Skoog با غلظت نصف حاوی 2٪ ساکارز (Fujifilm Wako Pure Chemical)، 0.05٪ (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) و 1.5٪ آگار (Fujifilm Wako Pure Chemical)، pH 5.7، در دمای 23 درجه سانتیگراد و نور ثابت کشت داده شدند. بذرهای جهش یافته phs1-1 توسط T. Hashimoto (موسسه علوم و فناوری نارا) تهیه شدند.
بذرهای سویه SR-1 توسط T. Hashimoto (موسسه علوم و فناوری نارا) تهیه و به عنوان گیاهان تنباکوی وحشی مورد استفاده قرار گرفتند. بذرهای تنباکو به صورت سطحی استریل شده و به مدت سه شب در آب استریل خیسانده شدند تا جوانه‌زنی افزایش یابد، سپس در محلولی با غلظت نصف حاوی 2٪ ساکارز، 0.05٪ (وزنی/حجمی) MES و 0.8٪ صمغ ژلان (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. و Skoog medium) با pH 5.7 قرار داده شده و در دمای 23 درجه سانتیگراد تحت نور ثابت انکوبه شدند.
سویه Tak-1 توسط T. Kohchi (دانشگاه کیوتو) تهیه شد و به عنوان واحد آزمایشی استاندارد برای مطالعه جگرواش مورد استفاده قرار گرفت. Gemma از گیاهان کشت شده استریل شده به دست آمد و سپس روی محیط کشت Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) حاوی 1٪ ساکارز و 0.3٪ صمغ ژلان کشت داده شد و در دمای 23 درجه سانتیگراد تحت نور مداوم انکوبه شد.
سلول‌های BY-2 تنباکو (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) توسط S. Hasezawa (دانشگاه توکیو) تهیه شدند. سلول‌های BY-2 در محیط کشت اصلاح‌شده Linsmeier و Skoog به میزان 95 برابر رقیق شدند و به صورت هفتگی با 2،4-دی‌کلروفنوکسی‌استیک اسید 32 تکمیل شدند. سوسپانسیون سلولی روی یک شیکر چرخشی با سرعت 130 دور در دقیقه در دمای 27 درجه سانتیگراد در تاریکی مخلوط شد. سلول‌ها را با 10 برابر حجم محیط کشت تازه بشویید و دوباره در همان محیط کشت به حالت تعلیق درآورید. رده‌های سلولی تراریخته BY-2 که به طور پایدار نشانگر ریزلوله TagRFP-TUA6 یا نشانگر رشته اکتین GFP-ABD2 را تحت پروموتر ویروس موزاییک گل کلم 35S بیان می‌کنند، همانطور که شرح داده شد، تولید شدند33،34،35. این رده‌های سلولی را می‌توان با استفاده از رویه‌هایی مشابه رویه‌های مورد استفاده برای رده سلولی اصلی BY-2 حفظ و همزمان‌سازی کرد.
سلول‌های HeLa در محیط کشت Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Life Technologies) حاوی 10% سرم جنین گاوی، 1.2 واحد در میلی‌لیتر پنی‌سیلین و 1.2 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با 5% CO2 کشت داده شدند.
تمام آزمایش‌های شرح داده شده در این مقاله مطابق با مقررات و دستورالعمل‌های ایمنی زیستی ژاپن انجام شده است.
ترکیبات در دی متیل سولفوکسید (DMSO؛ Fujifilm Wako Pure Chemical) به عنوان محلول‌های پایه حل شدند و در محیط کشت MS برای آرابیدوپسیس و تنباکو یا محیط کشت Gamborg B5 برای جگر گاو رقیق شدند. برای سنجش مهار رشد ریشه، بیش از 10 بذر در هر پلیت روی محیط کشت آگار حاوی ترکیبات ذکر شده یا DMSO کاشته شدند. بذرها به مدت 7 روز در اتاقک رشد انکوبه شدند. از نهال‌ها عکس گرفته شد و طول ریشه‌ها اندازه‌گیری شد. برای سنجش جوانه‌زنی آرابیدوپسیس، 48 بذر در هر پلیت روی محیط کشت آگار حاوی 200 میکرومولار ترکیب یا DMSO کاشته شدند. بذرهای آرابیدوپسیس در اتاقک رشد کشت داده شدند و تعداد نهال‌های جوانه‌زده 7 روز پس از جوانه‌زنی (dag) شمارش شد. برای سنجش جوانه‌زنی توتون، 24 بذر در هر پلیت روی محیط کشت آگار حاوی 200 میکرومولار KAND یا DMSO کاشته شدند. بذرهای توتون در اتاقک رشد کشت داده شدند و تعداد نهال‌های جوانه‌زده پس از 14 روز شمارش شد. برای سنجش مهار رشد جگرواش، 9 جنین از هر پلیت روی محیط آگار حاوی غلظت‌های مشخص‌شده KAND یا DMSO کشت داده شدند و به مدت 14 روز در اتاقک رشد انکوبه شدند.
برای مشاهده‌ی سازماندهی مریستم ریشه، از گیاهچه‌های رنگ‌آمیزی‌شده با 5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر پروپیدیوم یدید (PI) استفاده کنید. سیگنال‌های PI با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس و با استفاده از میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال TCS SPE (Leica Microsystems) مشاهده شدند.
رنگ‌آمیزی هیستوشیمیایی ریشه‌ها با بتا-گلوکورونیداز (GUS) طبق پروتکل شرح داده شده توسط مالامی و بنفی36 انجام شد. نهال‌ها به مدت یک شب در استون 90٪ تثبیت شدند، به مدت 1 ساعت با 0.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر 5-برومو-4-کلرو-3-ایندولیل-β-d-گلوکورونیک اسید در بافر GUS رنگ‌آمیزی شدند و در محلول کلرآلدئید هیدراته (8 گرم هیدرات کلرال، 2 میلی‌لیتر آب و 1 میلی‌لیتر گلیسرول) قرار داده شدند و با میکروسکوپ کنتراست تداخلی افتراقی با استفاده از میکروسکوپ Axio Imager M1 (کارل زایس) مشاهده شدند.
زوایای ریشه روی نهال‌های ۷ روزه که روی صفحات عمودی قرار داده شده بودند، اندازه‌گیری شد. زاویه ریشه را نسبت به جهت بردار جاذبه، همانطور که در مرحله ۶ توضیح داده شد، اندازه‌گیری کنید.
چیدمان میکروتوبول‌های قشری همانطور که شرح داده شد، با اصلاحات جزئی در پروتکل ۳۷، رعایت شد. آنتی‌بادی ضد بتا-توبولین (KMX-1، Merk Millipore: MAB3408) و آنتی‌بادی IgG ضد موش متصل به Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) به ترتیب به عنوان آنتی‌بادی‌های اولیه و ثانویه در رقت‌های ۱:۱۰۰۰ و ۱:۱۰۰ استفاده شدند. تصاویر فلورسانس با استفاده از میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال TCS SPE (Leica Microsystems) به دست آمدند. تصاویر Z-stack را تهیه کرده و طبق دستورالعمل سازنده، حداکثر شدت تصویر را ایجاد کنید.
سنجش تکثیر سلولی HeLa با استفاده از کیت شمارش سلولی شماره ۸ (Dojindo) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد.
رشد E. coli DH5α با اندازه‌گیری تراکم سلولی در کشت با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر (OD600) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
سازماندهی اسکلت سلولی در سلول‌های BY-2 تراریخته با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مجهز به دستگاه اسکن کانفوکال CSU-X1 (Yokogawa) و دوربین sCMOS (Zyla، Andor Technology) مشاهده شد. تراکم اسکلت سلولی با تجزیه و تحلیل تصویر ارزیابی شد که درصد پیکسل‌های اسکلت سلولی را در بین پیکسل‌های سیتوپلاسمی در تصاویر کانفوکال با استفاده از نرم‌افزار ImageJ همانطور که شرح داده شد، تعیین کرد.38،39
برای تشخیص مرگ سلولی در سلول‌های BY-2، بخشی از سوسپانسیون سلولی به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق با 0.05٪ رنگ آبی ایوانز انکوبه شد. رنگ‌آمیزی انتخابی آبی ایوانز سلول‌های مرده به خروج رنگ از سلول‌های زنده توسط غشای پلاسمایی سالم بستگی دارد40. سلول‌های رنگ‌آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ میدان روشن (BX53، Olympus) مشاهده شدند.
سلول‌های HeLa در محیط کشت DMEM حاوی 10% FBS در انکوباتور مرطوب با دمای 37 درجه سانتیگراد و 5% CO2 کشت داده شدند. سلول‌ها به مدت 6 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد با 100 میکرومولار KAND 11، اسید کوماموناریک 6، کومامونامیر 1، 100 نانوگرم در میلی‌لیتر کلسمید (Gibco) یا 100 نانوگرم در میلی‌لیتر نوکودماز (Sigma) تیمار شدند. سلول‌ها به مدت 10 دقیقه با MetOH و سپس به مدت 5 دقیقه با استات در دمای اتاق تثبیت شدند. سلول‌های تثبیت‌شده با آنتی‌بادی اولیه بتا-توبولین (1D4A4، Proteintech: 66240-1) رقیق‌شده در 0.5% BSA/PBS به مدت 2 ساعت انکوبه شدند، 3 بار با TBST شسته شدند و سپس با آنتی‌بادی بز Alexa Fluor انکوبه شدند. 488 1 ساعت. – IgG موش (Thermo Fisher Scientific: A11001) و 15 نانوگرم در میلی‌لیتر 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) رقیق شده در 0.5% BSA/PBS. پس از سه بار شستشو با TBST، سلول‌های رنگ‌آمیزی شده با میکروسکوپ معکوس Nikon Eclipse Ti-E مشاهده شدند. تصاویر با دوربین CCD خنک شده Hamamatsu ORCA-R2 با استفاده از نرم‌افزار MetaMorph (Molecular Devices) گرفته شدند.
زمان ارسال: ۱۷ ژوئن ۲۰۲۴