ارزیابی ید و اورمکتین به عنوان محرک‌های بیماری نماتد کاج

نماتد کاج یک انگل داخلی مهاجر قرنطینه ای است که به دلیل خسارات اقتصادی شدید در اکوسیستم های جنگلی کاج شناخته شده است. مطالعه حاضر به بررسی فعالیت نماتدکش ایندول های هالوژنه در برابر نماتدهای کاج و مکانیسم اثر آنها می پردازد. فعالیت های نماتدکش 5-iodoindole و avermectin (کنترل مثبت) در برابر نماتدهای کاج مشابه و در غلظت های پایین (10 میکروگرم در میلی لیتر) بود. 5-iodoindole باروری، فعالیت تولیدمثلی، مرگ و میر جنینی و لارو، و رفتار حرکتی را کاهش داد. فعل و انفعالات مولکولی لیگاندها با گیرنده های کانال کلرید دردار گلوتامات اختصاصی بی مهرگان از این ایده حمایت می کند که 5-iodoindole، مانند اورمکتین، محکم به محل فعال گیرنده متصل می شود. 5-Iodoindole همچنین باعث ایجاد تغییر شکل‌های فنوتیپی مختلف در نماتدها، از جمله فروپاشی / انقباض غیرطبیعی اندام و افزایش واکوئل‌سازی شد. این نتایج نشان می دهد که واکوئل ها ممکن است در مرگ ناشی از متیلاسیون نماتد نقش داشته باشند. نکته مهم، 5-iodoindole برای هر دو گونه گیاهی (کلم و تربچه) غیر سمی بود. بنابراین، این مطالعه نشان می دهد که کاربرد یدودینول در شرایط محیطی می تواند آسیب پژمردگی کاج را کنترل کند.
نماتد چوب کاج (Bursaphelenchus xylophilus) متعلق به نماتدهای چوب کاج (PWN) است، نماتدهای درون انگلی مهاجر که باعث آسیب زیست محیطی شدید به اکوسیستم های جنگلی کاج می شوند. بیماری پژمردگی کاج (PWD) ناشی از نماتد چوب کاج در حال تبدیل شدن به یک مشکل جدی در چندین قاره از جمله آسیا و اروپا است و در آمریکای شمالی، نماتد گونه‌های کاج معرفی شده را از بین می‌برد. کاهش درخت کاج یک مشکل بزرگ اقتصادی است و چشم انداز گسترش جهانی آن نگران کننده است. گونه های کاج زیر بیشتر توسط نماتد مورد حمله قرار می گیرند: Pinus densiflora، Pinus sylvestris، Pinus thunbergii، Pinus koraiensis، Pinus thunbergii، Pinus thunbergii، و Pinus radiata4. نماتد کاج یک بیماری جدی است که می تواند درختان کاج را ظرف چند هفته یا چند ماه پس از آلودگی از بین ببرد. علاوه بر این، شیوع نماتد کاج در انواع اکوسیستم‌ها رایج است، بنابراین زنجیره‌های عفونت پایدار ایجاد شده‌اند.
Bursaphelenchus xylophilus یک نماتد گیاهی-انگلی قرنطینه ای متعلق به ابرخانواده Aphelenchoidea و کلاد 102.5 است. نماتد از قارچ ها تغذیه می کند و در بافت های چوبی درختان کاج تکثیر می شود و به چهار مرحله لاروی مختلف تبدیل می شود: L1، L2، L3، L4 و یک فرد بالغ1،6. در شرایط کمبود غذا، نماتد کاج وارد مرحله لاروی تخصصی - داوئر می شود که ناقل آن - سوسک پوست درخت کاج (Monochamus alternatus) را انگلی می کند و به درختان کاج سالم منتقل می شود. در میزبان های سالم، نماتدها به سرعت از طریق بافت های گیاهی مهاجرت می کنند و از سلول های پارانشیمی تغذیه می کنند، که منجر به تعدادی واکنش های حساسیت، پژمردگی کاج و مرگ در طی یک سال پس از عفونت می شود1،7،8.
کنترل بیولوژیکی نماتدهای کاج برای مدت طولانی با اقدامات قرنطینه ای به قرن بیستم یک چالش تبدیل شده است. استراتژی‌های کنونی برای کنترل نماتدهای کاج عمدتاً شامل درمان‌های شیمیایی، از جمله بخور چوب و کاشت نماتدکش‌ها در تنه درختان است. متداول ترین نماتدکش ها اورمکتین و اورمکتین بنزوات هستند که از خانواده اورمکتین ها هستند. این مواد شیمیایی گران قیمت در برابر بسیاری از گونه های نماتد بسیار موثر هستند و از نظر محیط زیست ایمن هستند. با این حال، انتظار می رود استفاده مکرر از این نماتدکش ها فشار انتخابی ایجاد کند که تقریباً به طور قطع منجر به ظهور نماتدهای مقاوم کاج می شود، همانطور که برای چندین آفات حشره مانند Leptinotarsa ​​decemlineata، Plutella xylostella و نماتدهای Trichostrongylus colubriformis و Ostertagia نشان داده شده است که به تدریج به آنها مقاومت نشان داده اند. اورمکتین 10،11،12. بنابراین، الگوهای مقاومت باید به طور منظم مورد مطالعه قرار گیرند و نماتدکش ها به طور مداوم غربالگری شوند تا اقدامات جایگزین، مقرون به صرفه و سازگار با محیط زیست برای کنترل PVD پیدا شود. در دهه های اخیر، تعدادی از نویسندگان استفاده از عصاره های گیاهی، اسانس ها و مواد فرار را به عنوان عوامل کنترل نماتد پیشنهاد کرده اند13،14،15،16.
ما اخیراً فعالیت نماتدکش ایندول، یک مولکول سیگنال دهنده بین سلولی و بین پادشاهی را در Caenorhabditis elegans نشان دادیم. ایندول یک سیگنال درون سلولی گسترده در اکولوژی میکروبی است که عملکردهای متعددی را کنترل می کند که بر فیزیولوژی میکروبی، تشکیل اسپور، پایداری پلاسمید، مقاومت دارویی، تشکیل بیوفیلم و حدت تأثیر می گذارد. فعالیت ایندول و مشتقات آن در برابر سایر نماتدهای بیماری زا مورد مطالعه قرار نگرفته است. در این مطالعه، ما فعالیت نماتدکش 34 ایندول را در برابر نماتدهای کاج بررسی کردیم و مکانیسم عمل قوی‌ترین 5-iodoindole را با استفاده از میکروسکوپ، عکاسی با گذشت زمان و آزمایش‌های اتصال مولکولی روشن کردیم و اثرات سمی آن را بر روی گیاهان با استفاده از روش جوانه‌زنی بذر ارزیابی کردیم.
غلظت بالای (> 1.0 میلی مولار) ایندول قبلاً گزارش شده است که اثر نماتدکشی بر نماتدها دارد. پس از تیمار B. xylophilus (مراحل زندگی مختلط) با ایندول یا 33 مشتق مختلف ایندول در 1 میلی مولار، مرگ و میر B. xylophilus با شمارش نماتدهای زنده و مرده در گروه کنترل و تیمار اندازه‌گیری شد. پنج ایندول فعالیت نماتدکشی قابل توجهی را نشان دادند. بقای گروه کنترل درمان نشده پس از 24 ساعت 7 ± 95 درصد بود. از 34 ایندول آزمایش شده، 5-iodoindole و 4-fluoroindole در 1 میلی مولار باعث مرگ 100٪ شد، در حالی که 5،6-difluoroindigo، متیلندول-7-کربوکسیلات، و 7-iodoindole تقریباً 50٪ مرگ و میر ایجاد کردند (جدول 1).
تأثیر 5-iodoindole بر تشکیل واکوئل و متابولیسم نماتد چوب کاج. (الف) اثر اورمکتین و 5-iodoindole بر روی نماتدهای نر بالغ، (B) تخم‌های نماتد مرحله L1 و (C) متابولیسم B. xylophilus، (i) واکوئل‌ها در ساعت صفر مشاهده نشد، درمان منجر به (ii) واکوئل، (iii) تجمع واکوئول‌ها، (iii) انباشته شدن واکوئل‌ها، (iii) واکوئل‌ها شد. ادغام واکوئل ها و (vi) تشکیل واکوئل های غول پیکر. فلش های قرمز نشان دهنده تورم واکوئل ها، فلش های آبی نشان دهنده ادغام واکوئل ها و فلش های سیاه نشان دهنده واکوئل های غول پیکر است. نوار مقیاس = 50 میکرومتر.
علاوه بر این، این مطالعه همچنین روند متوالی مرگ ناشی از متان را در نماتدهای کاج توضیح داد (شکل 4C). مرگ متانوژنیک نوع غیر آپوپتوتیک مرگ سلولی است که با تجمع واکوئل های سیتوپلاسمی برجسته همراه است. نقایص مورفولوژیکی مشاهده شده در نماتدهای کاج به نظر می رسد که ارتباط نزدیکی با مکانیسم مرگ ناشی از متان داشته باشد. بررسی میکروسکوپی در زمان های مختلف نشان داد که واکوئل های غول پیکر پس از 20 ساعت قرار گرفتن در معرض 5-iodoindole (0.1 میلی مولار) تشکیل شده است. واکوئل های میکروسکوپی پس از 8 ساعت درمان مشاهده شد و تعداد آنها پس از 12 ساعت افزایش یافت. چندین واکوئل بزرگ پس از 14 ساعت مشاهده شد. چندین واکوئل ذوب شده پس از 12 تا 16 ساعت درمان به وضوح قابل مشاهده بودند، که نشان می دهد همجوشی واکوئل اساس مکانیسم مرگ متانوژنیک است. پس از 20 ساعت، چندین واکوئل غول پیکر در سراسر کرم پیدا شد. این مشاهدات نشان دهنده اولین گزارش متووز در سی.الگانس است.
در کرم های تیمار شده با 5-iodoindole، تجمع و پارگی واکوئل نیز مشاهده شد (شکل 5)، که با خم شدن کرم و انتشار واکوئل در محیط مشهود است. اختلال واکوئل نیز در غشای پوسته تخم مرغ مشاهده شد که به طور معمول توسط L2 در طول جوجه ریزی دست نخورده حفظ می شود (شکل تکمیلی S2). این مشاهدات از دخالت تجمع مایع و نارسایی تنظیم اسمزی، و همچنین آسیب سلولی برگشت پذیر (RCI) در فرآیند تشکیل واکوئل و چروک حمایت می کند (شکل 5).
فرضیه نقش ید در تشکیل واکوئل مشاهده شده، ما فعالیت نماتدکش یدید سدیم (NaI) و یدید پتاسیم (KI) را بررسی کردیم. با این حال، در غلظت‌های (0.1، 0.5 یا 1 میلی‌مولار)، آن‌ها بر بقای نماتد یا تشکیل واکوئل تأثیری نداشتند (شکل S5 تکمیلی)، اگرچه 1 میلی‌مولار KI اثر نماتدکشی خفیفی داشت. از سوی دیگر، 7-iodoindole (1 یا 2 mm)، مانند 5-iodoindole، واکوئل های متعدد و تغییر شکل های ساختاری را القا کرد (شکل تکمیلی S6). دو یدودینول ویژگی‌های فنوتیپی مشابهی را در نماتدهای کاج نشان دادند، در حالی که NaI و KI نداشتند. جالب اینجاست که ایندول در غلظت‌های آزمایش‌شده باعث ایجاد واکوئل در B. xylophilus نمی‌شود (داده‌ها نشان داده نشده است). بنابراین، نتایج تایید کرد که کمپلکس ایندول-ید مسئول واکوئل شدن و متابولیسم B. xylophilus است.
در میان ایندول‌های آزمایش‌شده برای فعالیت نماتیک‌کشی، 5-iodoindole دارای بالاترین شاخص لغزش 89/5- کیلوکالری بر مول بود و پس از آن 7-یودویندول (48/4- کیلوکالری در مول)، 4- فلورویندول (33/4-) و ایندول (03/4-) قرار گرفتند (شکل ). پیوند هیدروژنی ستون فقرات قوی 5-iodoindole به لوسین 218 اتصال آن را تثبیت می کند، در حالی که سایر مشتقات ایندول از طریق پیوندهای هیدروژنی زنجیره جانبی به سرین 260 متصل می شوند. در میان سایر یدودیندول های مدل شده، 2-iodoindole دارای ارزش اتصال 5.248- کیلوکالری بر مول است که به دلیل پیوند هیدروژنی اصلی آن با لوسین 218 است. سایر اتصالات شناخته شده عبارتند از: 3-iodoindole (-4.3 kcal/mol)، 4-iodoindole (-4.-kcal/mol) و 6.-m. kcal/mol) (شکل تکمیلی S8). بیشتر ایندول های هالوژنه و خود ایندول، به استثنای 5-iodoindole و 2-iodoindole، پیوندی با سرین 260 ایجاد می کنند. 2-iodoindole، مانند ایورمکتین، محکم به محل فعال گیرنده GluCL از طریق لوسین 218 متصل می شود (شکل 6 و شکل مکمل S8). ما پیشنهاد می کنیم که این اتصال برای حفظ ساختار منافذ باز کمپلکس GluCL لازم است و با اتصال محکم به محل فعال گیرنده GluCL، 5-iodoindole، 2-iodoindole، avermectin و ivermectin بنابراین کانال یونی را باز نگه می دارد و امکان جذب مایع را فراهم می کند.
اتصال مولکولی ایندول و ایندول هالوژنه به GluCL. جهت اتصال (A) ایندول، (B) 4-fluoroindole، (C) 7-iodoindole، و (D) لیگاندهای 5-iodoindole به محل فعال GluCL. پروتئین با یک روبان نشان داده می شود و پیوندهای هیدروژنی ستون فقرات به صورت خطوط نقطه زرد نشان داده می شوند. (A')، (B')، (C') و (D') برهمکنش لیگاندهای مربوطه را با باقیمانده‌های اسید آمینه اطراف نشان می‌دهند و پیوندهای هیدروژنی زنجیره جانبی با فلش‌های نقطه‌دار صورتی نشان داده می‌شوند.
آزمایش‌هایی برای ارزیابی اثر سمی 5-iodoindole بر جوانه‌زنی بذر کلم و تربچه انجام شد. 5-iodoindole (0.05 یا 0.1 میلی‌مولار) یا اورمکتین (10 میکروگرم در میلی‌لیتر) تأثیر کمی بر جوانه‌زنی اولیه و سبز شدن گیاهچه داشتند (شکل 7). علاوه بر این، تفاوت معنی داری بین سرعت جوانه زنی شاهد تیمار نشده و بذرهای تیمار شده با 5-iodoindole یا avermectin مشاهده نشد. اثر بر افزایش طول ریشه و تعداد ریشه های جانبی تشکیل شده ناچیز بود، اگرچه 1 میلی مولار (10 برابر غلظت فعال آن) 5-iodoindole رشد ریشه های جانبی را اندکی به تاخیر انداخت. این نتایج نشان می‌دهد که 5-iodoindole برای سلول‌های گیاهی غیرسمی است و در غلظت‌های مورد مطالعه با فرآیندهای رشد گیاه تداخلی ندارد.
اثر 5-iodoindole بر جوانه زنی بذر. جوانه زنی، جوانه زدن و ریشه زایی جانبی بذرهای B. oleracea و R. raphanistrum در محیط کشت موراشیگه و اسکوگ آگار با یا بدون اورمکتین یا 5-iodoindole. جوانه زنی پس از 3 روز انکوباسیون در دمای 22 درجه سانتی گراد ثبت شد.
این مطالعه چندین مورد از کشتن نماتد توسط ایندول را گزارش می دهد. نکته مهم این است که این اولین گزارش از متیلاسیون القا کننده یدودینول (فرآیندی ناشی از تجمع واکوئل های کوچکی است که به تدریج در واکوئل های غول پیکر ادغام می شوند و در نهایت منجر به پارگی غشاء و مرگ می شوند) در سوزن های کاج، با یدودینول خواص نماتدکشی قابل توجهی شبیه به نماتدکش های تجاری averm نشان می دهد.
قبلا گزارش شده بود که ایندول ها عملکردهای سیگنال دهی متعددی را در پروکاریوت ها و یوکاریوت ها اعمال می کنند، از جمله مهار/تشکیل بیوفیلم، بقای باکتری ها و بیماری زایی 19،32،33،34. اخیراً، اثرات درمانی بالقوه ایندول های هالوژنه، آلکالوئیدهای ایندول و مشتقات ایندول نیمه مصنوعی توجه تحقیقات گسترده ای را به خود جلب کرده است. به عنوان مثال، نشان داده شده است که ایندول هالوژنه سلول های اشرشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس پایدار را می کشد. علاوه بر این، مطالعه کارایی ایندول های هالوژنه بر سایر گونه ها، جنس ها و پادشاهی ها از اهمیت علمی برخوردار است و این مطالعه گامی در جهت دستیابی به این هدف است.
در اینجا، ما مکانیزمی را برای کشندگی ناشی از 5-iodoindole در C. elegans بر اساس آسیب سلولی برگشت پذیر (RCI) و متیلاسیون پیشنهاد می کنیم (شکل 4C و 5). تغییرات ادماتوز مانند پف کردگی و دژنراسیون واکوئلی شاخص های RCI و متیلاسیون هستند که به صورت واکوئل های غول پیکر در سیتوپلاسم ظاهر می شوند. RCI با کاهش تولید ATP، باعث از کار افتادن پمپ ATPase یا مختل کردن غشای سلولی و ایجاد هجوم سریع Na+، Ca2+ و آب 50،51،52، در تولید انرژی تداخل می‌کند. واکوئل های داخل سیتوپلاسمی در سلول های حیوانی در نتیجه تجمع مایع در سیتوپلاسم به دلیل هجوم Ca2+ و آب به وجود می آیند. جالب است که این مکانیسم آسیب سلولی در صورتی که آسیب موقتی باشد و سلول ها شروع به تولید ATP برای مدت معینی کنند، برگشت پذیر است، اما اگر آسیب ادامه یابد یا بدتر شود، سلول ها می میرند.54 مشاهدات ما نشان می دهد که نماتدهای تیمار شده با 5-iodoindole قادر به بازگرداندن بیوسنتز طبیعی پس از قرار گرفتن در شرایط استرس نیستند.
فنوتیپ متیلاسیون القا شده توسط 5-iodoindole در B. xylophilus ممکن است به دلیل وجود ید و توزیع مولکولی آن باشد، زیرا 7-iodoindole نسبت به 5-iodoindole اثر بازدارندگی کمتری بر B. xylophilus داشت (جدول 1 و شکل تکمیلی S6). این نتایج تا حدی با مطالعات مالتی و همکاران مطابقت دارد. (2014)، که گزارش کرد که جابجایی نیمه نیتروژن پیریدیل در ایندول از موقعیت پارا به موقعیت متا، واکوئل شدن، مهار رشد و سمیت سلولی را در سلول‌های U251 لغو کرد، و نشان می‌دهد که برهمکنش مولکول با یک مکان فعال خاص در پروتئین حیاتی است. فعل و انفعالات بین ایندول یا ایندول هالوژنه و گیرنده های GluCL مشاهده شده در این مطالعه نیز از این مفهوم حمایت می کند، زیرا 5- و 2-iodoindole نسبت به سایر ایندول های مورد بررسی قوی تر به گیرنده های GluCL متصل می شوند (شکل 6 و شکل تکمیلی S8). مشخص شد که ید در موقعیت دوم یا پنجم ایندول از طریق پیوندهای هیدروژنی ستون فقرات به لوسین 218 گیرنده GluCL متصل می شود، در حالی که سایر ایندول های هالوژنه و خود ایندول پیوندهای هیدروژنی زنجیره جانبی ضعیفی را با سرین 260 تشکیل می دهند (شکل 6). بنابراین ما حدس می زنیم که محلی سازی هالوژن نقش مهمی در القای انحطاط واکوئولی ایفا می کند، در حالی که اتصال محکم 5-iodoindole کانال یونی را باز نگه می دارد و در نتیجه امکان هجوم سریع مایع و پارگی واکوئل را فراهم می کند. با این حال، مکانیسم دقیق عمل 5-iodoindole هنوز مشخص نیست.
قبل از استفاده عملی از 5-iodoindole، باید اثر سمی آن بر گیاهان مورد تجزیه و تحلیل قرار گیرد. آزمایش‌های جوانه‌زنی بذر ما نشان داد که 5-iodoindole هیچ اثر منفی بر جوانه‌زنی بذر یا فرآیندهای رشد بعدی در غلظت‌های مورد مطالعه نداشت (شکل 7). بنابراین، این مطالعه مبنایی برای استفاده از 5-iodoindole در محیط زیست محیطی برای کنترل مضرات نماتدهای کاج برای درختان کاج فراهم می‌کند.
گزارش‌های قبلی نشان داده‌اند که درمان مبتنی بر ایندول یک رویکرد بالقوه برای رسیدگی به مشکل مقاومت آنتی‌بیوتیکی و پیشرفت سرطان است. علاوه بر این، ایندول ها دارای فعالیت های ضد باکتری، ضد سرطان، آنتی اکسیدان، ضد التهاب، ضد دیابت، ضد ویروسی، ضد تکثیر و ضد سل هستند و ممکن است به عنوان پایه ای امیدوار کننده برای توسعه داروها عمل کنند. این مطالعه برای اولین بار استفاده بالقوه از ید به عنوان یک عامل ضد انگلی و ضد کرم را پیشنهاد می کند.
Avermectin سه دهه پیش کشف شد و در سال 2015 برنده جایزه نوبل شد و استفاده از آن به عنوان یک ضد کرم هنوز به طور فعال ادامه دارد. با این حال، با توجه به توسعه سریع مقاومت به اورمکتین ها در نماتدها و آفات حشرات، یک استراتژی جایگزین، کم هزینه و سازگار با محیط زیست برای کنترل عفونت PWN در درختان کاج مورد نیاز است. این مطالعه همچنین مکانیسمی را گزارش می‌کند که توسط آن نماتدهای کاج 5-iodoindole را می‌کشد و اینکه 5-iodoindole سمیت کمی برای سلول‌های گیاهی دارد، که چشم‌انداز خوبی را برای کاربرد تجاری آن در آینده باز می‌کند.
تمامی آزمایش‌ها توسط کمیته اخلاق دانشگاه یونگنام، گیونگ‌سان، کره تأیید شد و روش‌ها مطابق با دستورالعمل‌های کمیته اخلاق دانشگاه یونگنام انجام شد.
آزمایش های جوجه کشی تخم مرغ با استفاده از روش های تعیین شده انجام شد. برای ارزیابی نرخ جوجه ریزی (HR)، نماتدهای بالغ یک روزه (تقریباً 100 ماده و 100 نر) به ظروف پتری حاوی قارچ منتقل شدند و به مدت 24 ساعت اجازه رشد دادند. سپس تخم‌ها جدا شده و با 5-iodoindole (0.05 میلی‌مولار و 0.1 میلی‌مولار) یا اورمکتین (10 میکروگرم بر میلی‌لیتر) به عنوان سوسپانسیون در آب مقطر استریل تیمار شدند. این سوسپانسیون ها (500 میکرولیتر؛ تقریباً 100 تخم) به چاهک های یک صفحه کشت بافت 24 چاهی منتقل شدند و در دمای 22 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. شمارش L2 پس از 24 ساعت انکوباسیون انجام شد، اما اگر سلول ها در هنگام تحریک با سیم پلاتین ریز حرکت نمی کردند، مرده در نظر گرفته می شدند. این آزمایش در دو مرحله و هر مرحله با شش تکرار انجام شد. داده های هر دو آزمایش ترکیب و ارائه شد. درصد HR به صورت زیر محاسبه می شود:
مرگ و میر لارو با استفاده از روش های قبلا توسعه یافته ارزیابی شد. تخم‌های نماتد جمع‌آوری شدند و جنین‌ها با تفریخ در آب مقطر استریل برای تولید لاروهای مرحله L2 هماهنگ شدند. لاروهای همگام (تقریباً 500 نماتد) با 5-iodoindole (0.05 میلی‌مولار و 0.1 میلی‌مولار) یا اورمکتین (10 میکروگرم در میلی‌لیتر) تیمار شدند و در صفحات پتری B. cinerea پرورش یافتند. پس از 48 ساعت انکوباسیون در دمای 22 درجه سانتیگراد، نماتدها در آب مقطر استریل جمع آوری شده و از نظر وجود مراحل L2، L3 و L4 مورد بررسی قرار گرفتند. حضور مراحل L3 و L4 نشان‌دهنده تبدیل لارو بود، در حالی که حضور مرحله L2 نشان‌دهنده عدم تغییر است. تصاویر با استفاده از سیستم تصویربرداری سلولی دیجیتال iRiS به دست آمدند. این آزمایش در دو مرحله و هر مرحله با شش تکرار انجام شد. داده های هر دو آزمایش ترکیب و ارائه شد.
سمیت 5-iodoindole و avermectin برای بذرها با استفاده از آزمایش‌های جوانه‌زنی روی پلیت‌های Murashige و Skoog agar ارزیابی شد.62 دانه‌های B. oleracea و R. raphanistrum ابتدا در آب مقطر استریل به مدت یک روز خیسانده شدند، با 1 میلی‌لیتر 100 درصد اتانول تجاری 100 درصد با اتانول تجاری 100 درصد استریل شسته شدند. هیپوکلریت سدیم) به مدت 15 دقیقه و پنج بار با 1 میلی لیتر آب استریل شسته شد. سپس بذرهای استریل شده بر روی صفحات آگار جوانه زنی حاوی 0.86 گرم در لیتر (0.2X) محیط کشت موراشیگه و اسکوگ و 0.7 درصد آگار باکتریولوژیک با یا بدون 5-iodoindole یا avermectin قرار گرفتند. سپس پلیت ها در دمای 22 درجه سانتی گراد انکوبه شدند و پس از 3 روز انکوباسیون تصاویر گرفته شد. این آزمایش در دو مرحله انجام شد که هر مرحله دارای شش تکرار بود.