ارزیابی ید و آورمکتین به عنوان القاکننده‌های بیماری نماتد کاج

نماتد کاج یک اندوپارازیت مهاجر قرنطینه‌ای است که به ایجاد خسارات اقتصادی شدید در اکوسیستم‌های جنگل‌های کاج معروف است. مطالعه حاضر به بررسی فعالیت نماتدکشی ایندول‌های هالوژنه علیه نماتدهای کاج و مکانیسم عمل آنها می‌پردازد. فعالیت‌های نماتدکشی 5-یدوایندول و آورمکتین (کنترل مثبت) علیه نماتدهای کاج در غلظت‌های پایین (10 میکروگرم در میلی‌لیتر) مشابه و بالا بود. 5-یدوایندول باعث کاهش باروری، فعالیت تولید مثلی، مرگ و میر جنینی و لاروی و رفتار حرکتی شد. برهمکنش‌های مولکولی لیگاندها با گیرنده‌های کانال کلرید دریچه‌دار گلوتامات مخصوص بی‌مهرگان، از این مفهوم پشتیبانی می‌کند که 5-یدوایندول، مانند آورمکتین، محکم به محل فعال گیرنده متصل می‌شود. 5-یدوایندول همچنین باعث تغییر شکل‌های فنوتیپی مختلفی در نماتدها، از جمله فروپاشی/کوچک شدن غیرطبیعی اندام و افزایش واکوئل‌سازی می‌شود. این نتایج نشان می‌دهد که واکوئل‌ها ممکن است در مرگ ناشی از متیلاسیون نماتد نقش داشته باشند. نکته مهم این است که 5-یدوایندول برای هر دو گونه گیاهی (کلم و تربچه) غیرسمی بود. بنابراین، این مطالعه نشان می‌دهد که کاربرد یدوایندول در شرایط محیطی می‌تواند آسیب پژمردگی کاج را کنترل کند.
نماتد چوب کاج (Bursaphelenchus xylophilus) متعلق به نماتدهای چوب کاج (PWN)، نماتدهای اندوپارازیت مهاجر هستند که به ایجاد آسیب‌های اکولوژیکی شدید به اکوسیستم‌های جنگل‌های کاج معروفند.1 بیماری پژمردگی کاج (PWD) که توسط نماتد چوب کاج ایجاد می‌شود، در چندین قاره از جمله آسیا و اروپا به یک مشکل جدی تبدیل شده است و در آمریکای شمالی، این نماتد گونه‌های کاج معرفی شده را از بین می‌برد.1،2. زوال درختان کاج یک مشکل اقتصادی بزرگ است و چشم‌انداز گسترش جهانی آن نگران‌کننده است.3 گونه‌های کاج زیر بیشتر مورد حمله این نماتد قرار می‌گیرند: Pinus densiflora، Pinus sylvestris، Pinus thunbergii، Pinus koraiensis، Pinus thunbergii، Pinus thunbergii و Pinus radiata4. نماتد کاج یک بیماری جدی است که می‌تواند درختان کاج را در عرض چند هفته یا چند ماه پس از عفونت از بین ببرد. علاوه بر این، شیوع نماتد کاج در اکوسیستم‌های مختلف رایج است، بنابراین زنجیره‌های آلودگی مداوم ایجاد شده‌اند.
Bursaphelenchus xylophilus یک نماتد انگل گیاهی قرنطینه‌ای متعلق به ابرخانواده Aphelenchoidea و کلاد 102.5 است. این نماتد از قارچ‌ها تغذیه می‌کند و در بافت‌های چوب درختان کاج تولید مثل می‌کند و به چهار مرحله لاروی مختلف تبدیل می‌شود: L1، L2، L3، L4 و یک فرد بالغ1،6. در شرایط کمبود غذا، نماتد کاج به یک مرحله لاروی تخصصی - dauer - منتقل می‌شود که ناقل خود - سوسک پوست کاج (Monochamus alternatus) - را انگلی می‌کند و به درختان کاج سالم منتقل می‌شود. در میزبان‌های سالم، نماتدها به سرعت از طریق بافت‌های گیاهی مهاجرت کرده و از سلول‌های پارانشیمی تغذیه می‌کنند که منجر به تعدادی واکنش‌های حساسیت بیش از حد، پژمردگی کاج و مرگ در عرض یک سال پس از عفونت می‌شود1،7،8.
کنترل بیولوژیکی نماتدهای کاج از دیرباز یک چالش بوده است و اقدامات قرنطینه‌ای به قرن بیستم برمی‌گردد. استراتژی‌های فعلی برای کنترل نماتدهای کاج در درجه اول شامل درمان‌های شیمیایی، از جمله بخور دادن چوب و کاشت نماتدکش‌ها در تنه درختان است. نماتدکش‌های رایج مورد استفاده، آورمکتین و بنزوات آورمکتین هستند که متعلق به خانواده آورمکتین هستند. این مواد شیمیایی گران‌قیمت در برابر بسیاری از گونه‌های نماتد بسیار مؤثر هستند و از نظر زیست‌محیطی بی‌خطر محسوب می‌شوند.9 با این حال، انتظار می‌رود استفاده مکرر از این نماتدکش‌ها فشار انتخابی ایجاد کند که تقریباً به طور قطع منجر به ظهور نماتدهای کاج مقاوم خواهد شد، همانطور که برای چندین آفت حشره مانند Leptinotarsa ​​decemlineata، Plutella xylostella و نماتدهای Trichostrongylus colubriformis و Ostertagia circumcincta نشان داده شده است که به تدریج در برابر آورمکتین‌ها مقاومت ایجاد کرده‌اند.10،11،12 بنابراین، الگوهای مقاومت باید به طور منظم مورد مطالعه قرار گیرند و نماتدکش‌ها به طور مداوم غربالگری شوند تا اقدامات جایگزین، مقرون به صرفه و سازگار با محیط زیست برای کنترل PVD پیدا شود. در دهه‌های اخیر، تعدادی از نویسندگان استفاده از عصاره‌های گیاهی، روغن‌های ضروری و مواد فرار را به عنوان عوامل کنترل نماتد پیشنهاد کرده‌اند13،14،15،16.
ما اخیراً فعالیت نماتدکشی ایندول، یک مولکول سیگنال‌دهنده بین سلولی و بین سلسله‌ای، را در Caenorhabditis elegans نشان دادیم [17]. ایندول یک سیگنال درون سلولی گسترده در اکولوژی میکروبی است که عملکردهای متعددی را که بر فیزیولوژی میکروبی، تشکیل اسپور، پایداری پلاسمید، مقاومت دارویی، تشکیل بیوفیلم و حدت تأثیر می‌گذارند، کنترل می‌کند [18، 19]. فعالیت ایندول و مشتقات آن در برابر سایر نماتدهای بیماری‌زا مورد مطالعه قرار نگرفته است. در این مطالعه، ما فعالیت نماتدکشی 34 ایندول را در برابر نماتدهای کاج بررسی کردیم و مکانیسم عمل قوی‌ترین 5-یدوایندول را با استفاده از میکروسکوپ، عکاسی مرور زمان و آزمایش‌های داکینگ مولکولی روشن کردیم و اثرات سمی آن را بر گیاهان با استفاده از سنجش جوانه‌زنی بذر ارزیابی کردیم.
قبلاً گزارش شده است که غلظت‌های بالای ایندول (بیش از 1.0 میلی‌مولار) اثر نماتدکشی بر روی نماتدها دارند17. پس از تیمار B. xylophilus (مراحل زندگی مختلط) با ایندول یا 33 مشتق مختلف ایندول در غلظت 1 میلی‌مولار، مرگ و میر B. xylophilus با شمارش نماتدهای زنده و مرده در گروه‌های کنترل و درمان شده اندازه‌گیری شد. پنج ایندول فعالیت نماتدکشی قابل توجهی نشان دادند. بقای گروه کنترل درمان نشده پس از 24 ساعت 95 ± 7٪ بود. از 34 ایندول آزمایش شده، 5-یدوایندول و 4-فلورویندول در غلظت 1 میلی‌مولار باعث 100٪ مرگ و میر شدند، در حالی که 5،6-دی‌فلورویندول، متیلیندول-7-کربوکسیلات و 7-یدوایندول تقریباً باعث 50٪ مرگ و میر شدند (جدول 1).
اثر 5-یدوایندول بر تشکیل واکوئل و متابولیسم نماتد چوب کاج. (الف) اثر آورمکتین و 5-یدوایندول بر نماتدهای نر بالغ، (ب) تخم‌های نماتد مرحله L1 و (ج) متابولیسم B. xylophilus، (i) واکوئل‌ها در زمان 0 ساعت مشاهده نشدند، تیمار منجر به (ii) واکوئل‌ها، (iii) تجمع واکوئل‌های متعدد، (iv) تورم واکوئل‌ها، (v) ادغام واکوئل‌ها و (vi) تشکیل واکوئل‌های غول‌پیکر شد. فلش‌های قرمز نشان دهنده تورم واکوئل‌ها، فلش‌های آبی نشان دهنده ادغام واکوئل‌ها و فلش‌های سیاه نشان دهنده واکوئل‌های غول‌پیکر هستند. نوار مقیاس = 50 میکرومتر.
علاوه بر این، این مطالعه فرآیند متوالی مرگ ناشی از متان را در نماتدهای کاج نیز توصیف کرد (شکل 4C). مرگ متانوژنیک نوعی مرگ سلولی غیر آپوپتوزی است که با تجمع واکوئل‌های سیتوپلاسمی برجسته مرتبط است27. به نظر می‌رسد نقص‌های مورفولوژیکی مشاهده شده در نماتدهای کاج ارتباط نزدیکی با مکانیسم مرگ ناشی از متان دارند. بررسی میکروسکوپی در زمان‌های مختلف نشان داد که واکوئل‌های غول‌پیکر پس از 20 ساعت قرار گرفتن در معرض 5-یدوایندول (0.1 میلی‌مولار) تشکیل شده‌اند. واکوئل‌های میکروسکوپی پس از 8 ساعت درمان مشاهده شدند و تعداد آنها پس از 12 ساعت افزایش یافت. چندین واکوئل بزرگ پس از 14 ساعت مشاهده شد. چندین واکوئل ذوب شده پس از 12 تا 16 ساعت درمان به وضوح قابل مشاهده بودند، که نشان می‌دهد ادغام واکوئل اساس مکانیسم مرگ متانوژنیک است. پس از 20 ساعت، چندین واکوئل غول‌پیکر در سراسر کرم یافت شد. این مشاهدات اولین گزارش از متوز در C. elegans را نشان می‌دهد.
در کرم‌های تیمار شده با 5-یدوایندول، تجمع و پارگی واکوئل نیز مشاهده شد (شکل 5)، که با خم شدن کرم و آزاد شدن واکوئل به محیط زیست نشان داده شد. همچنین اختلال واکوئل در غشای پوسته تخم مرغ مشاهده شد که معمولاً توسط L2 در طول تفریخ تخم دست نخورده باقی می‌ماند (شکل تکمیلی S2). این مشاهدات از دخالت تجمع مایع و نارسایی تنظیم اسمزی و همچنین آسیب سلولی برگشت‌پذیر (RCI) در فرآیند تشکیل واکوئل و ترشح چرک پشتیبانی می‌کند (شکل 5).
با فرض نقش ید در تشکیل واکوئل مشاهده شده، فعالیت نماتدکشی یدید سدیم (NaI) و یدید پتاسیم (KI) را بررسی کردیم. با این حال، در غلظت‌های (0.1، 0.5 یا 1 میلی‌مولار)، آنها نه بر بقای نماتد و نه بر تشکیل واکوئل تأثیری نداشتند (شکل تکمیلی S5)، اگرچه 1 میلی‌مولار KI اثر نماتدکشی کمی داشت. از سوی دیگر، 7-یدوایندول (1 یا 2 میلی‌مولار)، مانند 5-یدوایندول، باعث ایجاد واکوئل‌های متعدد و تغییر شکل‌های ساختاری شد (شکل تکمیلی S6). دو یدوایندول ویژگی‌های فنوتیپی مشابهی را در نماتدهای کاج نشان دادند، در حالی که NaI و KI این ویژگی‌ها را نداشتند. جالب توجه است که ایندول در غلظت‌های آزمایش شده باعث تشکیل واکوئل در B. xylophilus نشد (داده‌ها نشان داده نشده‌اند). بنابراین، نتایج تأیید کرد که کمپلکس ایندول-ید مسئول واکوئل‌سازی و متابولیسم B. xylophilus است.
در میان ایندول‌های آزمایش‌شده برای فعالیت نماتدکشی، 5-یدوایندول بالاترین شاخص لغزش 5.89- کیلوکالری بر مول را داشت و پس از آن 7-یدوایندول (4.48- کیلوکالری بر مول)، 4-فلورویندول (4.33-) و ایندول (4.03-) قرار داشتند (شکل 6). پیوند هیدروژنی قوی 5-یدوایندول به لوسین 218، اتصال آن را پایدار می‌کند، در حالی که سایر مشتقات ایندول از طریق پیوندهای هیدروژنی زنجیره جانبی به سرین 260 متصل می‌شوند. در میان سایر یدوایندول‌های مدل‌سازی‌شده، ۲-یدوایندول دارای مقدار اتصال -۵.۲۴۸ کیلوکالری بر مول است که به دلیل پیوند هیدروژنی اصلی آن با لوسین ۲۱۸ است. سایر اتصالات شناخته‌شده شامل ۳-یدوایندول (-۴.۳ کیلوکالری بر مول)، ۴-یدوایندول (-۴.۰ کیلوکالری بر مول) و ۶-فلورویندول (-۲.۶ کیلوکالری بر مول) است (شکل تکمیلی S8). بیشتر ایندول‌های هالوژنه و خود ایندول، به استثنای 5-یدوایندول و 2-یدوایندول، با سرین 260 پیوند تشکیل می‌دهند. این واقعیت که پیوند هیدروژنی با لوسین 218 نشان دهنده اتصال کارآمد گیرنده-لیگاند است، همانطور که برای ایورمکتین مشاهده شد (شکل تکمیلی S7)، تأیید می‌کند که 5-یدوایندول و 2-یدوایندول، مانند ایورمکتین، از طریق لوسین 218 محکم به محل فعال گیرنده GluCL متصل می‌شوند (شکل 6 و شکل تکمیلی S8). ما پیشنهاد می‌کنیم که این اتصال برای حفظ ساختار منافذ باز کمپلکس GluCL لازم است و با اتصال محکم به محل فعال گیرنده GluCL، 5-یدوایندول، 2-یدوایندول، آورمکتین و ایورمکتین، کانال یونی را باز نگه می‌دارند و امکان جذب مایعات را فراهم می‌کنند.
داکینگ مولکولی ایندول و ایندول هالوژنه شده به GluCL. جهت‌گیری‌های اتصال لیگاندهای (A) ایندول، (B) 4-فلورویندول، (C) 7-یدوایندول و (D) 5-یدوایندول به جایگاه فعال GluCL. پروتئین توسط یک روبان نشان داده شده است و پیوندهای هیدروژنی اسکلت به صورت خطوط نقطه‌چین زرد نشان داده شده‌اند. (A′)، (B′)، (C′) و (D′) برهمکنش‌های لیگاندهای مربوطه با باقیمانده‌های اسید آمینه اطراف را نشان می‌دهند و پیوندهای هیدروژنی زنجیره جانبی توسط فلش‌های نقطه‌چین صورتی نشان داده شده‌اند.
آزمایش‌هایی برای ارزیابی اثر سمی 5-یدوایندول بر جوانه‌زنی بذر کلم و تربچه انجام شد. 5-یدوایندول (0.05 یا 0.1 میلی‌مولار) یا آورمکتین (10 میکروگرم در میلی‌لیتر) تأثیر کمی بر جوانه‌زنی اولیه و ظهور گیاهچه داشتند یا اصلاً تأثیری نداشتند (شکل 7). علاوه بر این، هیچ تفاوت معنی‌داری بین سرعت جوانه‌زنی شاهدهای تیمار نشده و بذرهای تیمار شده با 5-یدوایندول یا آورمکتین مشاهده نشد. تأثیر بر طویل شدن ریشه اصلی و تعداد ریشه‌های جانبی تشکیل شده ناچیز بود، اگرچه 1 میلی‌مولار (10 برابر غلظت فعال آن) 5-یدوایندول کمی توسعه ریشه‌های جانبی را به تأخیر انداخت. این نتایج نشان می‌دهد که 5-یدوایندول برای سلول‌های گیاهی غیرسمی است و در غلظت‌های مورد مطالعه در فرآیندهای رشد گیاه اختلال ایجاد نمی‌کند.
اثر ۵-یدوایندول بر جوانه‌زنی بذر. جوانه‌زنی، سبز شدن و ریشه‌زایی جانبی بذرهای B. oleracea و R. raphanistrum در محیط کشت آگار Murashige and Skoog با یا بدون avermectin یا ۵-یدوایندول. جوانه‌زنی پس از ۳ روز انکوباسیون در دمای ۲۲ درجه سانتی‌گراد ثبت شد.
این مطالعه چندین مورد از کشتن نماتدها توسط ایندول‌ها را گزارش می‌دهد. نکته مهم این است که این اولین گزارش از متیلاسیون القا شده توسط یدوایندول (فرآیندی که در اثر تجمع واکوئل‌های کوچک ایجاد می‌شود که به تدریج در واکوئل‌های غول‌پیکر ادغام می‌شوند و در نهایت منجر به پارگی غشا و مرگ می‌شوند) در سوزن‌های کاج است، به طوری که یدوایندول خواص نماتدکشی قابل توجهی مشابه با نماتدکش تجاری آورمکتین از خود نشان می‌دهد.
پیش از این گزارش شده است که ایندول‌ها عملکردهای سیگنالینگ متعددی را در پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها اعمال می‌کنند، از جمله مهار/تشکیل بیوفیلم، بقای باکتری‌ها و بیماری‌زایی19،32،33،34. اخیراً، اثرات درمانی بالقوه ایندول‌های هالوژنه، آلکالوئیدهای ایندول و مشتقات نیمه‌سنتزی ایندول، توجه تحقیقات گسترده‌ای را به خود جلب کرده است35،36،37. به عنوان مثال، نشان داده شده است که ایندول‌های هالوژنه سلول‌های مقاوم اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس را از بین می‌برند37. علاوه بر این، مطالعه اثربخشی ایندول‌های هالوژنه در برابر سایر گونه‌ها، جنس‌ها و سلسله‌ها از نظر علمی مورد توجه است و این مطالعه گامی در جهت دستیابی به این هدف است.
در اینجا، ما مکانیسمی را برای مرگ و میر ناشی از 5-یدوایندول در C. elegans بر اساس آسیب سلولی برگشت‌پذیر (RCI) و متیلاسیون پیشنهاد می‌کنیم (شکل‌های 4C و 5). تغییرات ادماتوز مانند پف‌آلودگی و دژنراسیون واکوئلی، شاخص‌های RCI و متیلاسیون هستند که به صورت واکوئل‌های غول‌پیکر در سیتوپلاسم ظاهر می‌شوند48،49. RCI با کاهش تولید ATP، ایجاد اختلال در پمپ ATPase یا اختلال در غشاهای سلولی و ایجاد هجوم سریع Na+، Ca2+ و آب50،51،52، در تولید انرژی اختلال ایجاد می‌کند. واکوئل‌های درون سیتوپلاسمی در سلول‌های حیوانی در نتیجه تجمع مایع در سیتوپلاسم به دلیل هجوم Ca2+ و آب53 ایجاد می‌شوند. جالب توجه است که این مکانیسم آسیب سلولی در صورتی که آسیب موقتی باشد و سلول‌ها برای مدت زمان مشخصی شروع به تولید ATP کنند، برگشت‌پذیر است، اما اگر آسیب ادامه یابد یا بدتر شود، سلول‌ها می‌میرند.54 مشاهدات ما نشان می‌دهد که نماتدهای تیمار شده با 5-یدوایندول قادر به بازیابی بیوسنتز طبیعی پس از قرار گرفتن در معرض شرایط استرس نیستند.
فنوتیپ متیلاسیون القا شده توسط 5-یدوایندول در B. xylophilus ممکن است به دلیل وجود ید و توزیع مولکولی آن باشد، زیرا 7-یدوایندول اثر مهاری کمتری بر B. xylophilus نسبت به 5-یدوایندول داشت (جدول 1 و شکل تکمیلی S6). این نتایج تا حدودی با مطالعات Maltese و همکاران (2014) سازگار است، که گزارش دادند انتقال بخش نیتروژن پیریدیل در ایندول از پارا به متا، واکوئلیزاسیون، مهار رشد و سمیت سلولی را در سلول‌های U251 از بین می‌برد، که نشان می‌دهد برهمکنش مولکول با یک جایگاه فعال خاص در پروتئین حیاتی است27،44،45. برهمکنش‌های بین ایندول یا ایندول‌های هالوژنه و گیرنده‌های GluCL مشاهده شده در این مطالعه نیز از این مفهوم پشتیبانی می‌کند، زیرا مشخص شد که 5- و 2-یدوایندول قوی‌تر از سایر ایندول‌های مورد بررسی به گیرنده‌های GluCL متصل می‌شوند (شکل 6 و شکل تکمیلی S8). مشخص شد که ید در موقعیت دوم یا پنجم ایندول از طریق پیوندهای هیدروژنی اصلی به لوسین ۲۱۸ گیرنده GluCL متصل می‌شود، در حالی که سایر ایندول‌های هالوژنه و خود ایندول پیوندهای هیدروژنی زنجیره جانبی ضعیفی با سرین ۲۶۰ تشکیل می‌دهند (شکل ۶). بنابراین، ما حدس می‌زنیم که قرارگیری هالوژن نقش مهمی در القای دژنراسیون واکوئلی دارد، در حالی که اتصال محکم ۵-یدوایندول، کانال یونی را باز نگه می‌دارد و در نتیجه امکان ورود سریع مایعات و پارگی واکوئل را فراهم می‌کند. با این حال، مکانیسم دقیق عمل ۵-یدوایندول هنوز مشخص نشده است.
قبل از کاربرد عملی 5-یدوایندول، اثر سمی آن بر گیاهان باید مورد تجزیه و تحلیل قرار گیرد. آزمایش‌های جوانه‌زنی بذر ما نشان داد که 5-یدوایندول هیچ اثر منفی بر جوانه‌زنی بذر یا فرآیندهای رشد بعدی در غلظت‌های مورد مطالعه ندارد (شکل 7). بنابراین، این مطالعه مبنایی برای استفاده از 5-یدوایندول در محیط زیست برای کنترل مضر بودن نماتدهای کاج برای درختان کاج فراهم می‌کند.
گزارش‌های قبلی نشان داده‌اند که درمان مبتنی بر ایندول، رویکردی بالقوه برای مقابله با مشکل مقاومت آنتی‌بیوتیکی و پیشرفت سرطان است55. علاوه بر این، ایندول‌ها دارای فعالیت‌های ضدباکتریایی، ضدسرطانی، آنتی‌اکسیدانی، ضدالتهابی، ضددیابتی، ضدویروسی، ضدتکثیری و ضدسل هستند و می‌توانند به عنوان پایه‌ای امیدوارکننده برای توسعه دارو عمل کنند56،57. این مطالعه برای اولین بار استفاده بالقوه از ید را به عنوان یک عامل ضدانگل و ضدکرم پیشنهاد می‌دهد.
آورمکتین سه دهه پیش کشف شد و در سال ۲۰۱۵ جایزه نوبل را از آن خود کرد و استفاده از آن به عنوان یک داروی ضد کرم هنوز هم به طور فعال ادامه دارد. با این حال، به دلیل توسعه سریع مقاومت به آورمکتین‌ها در نماتدها و آفات حشرات، یک استراتژی جایگزین، کم‌هزینه و سازگار با محیط زیست برای کنترل عفونت PWN در درختان کاج مورد نیاز است. این مطالعه همچنین مکانیسمی را گزارش می‌دهد که از طریق آن ۵-یدوایندول نماتدهای کاج را از بین می‌برد و اینکه ۵-یدوایندول سمیت کمی برای سلول‌های گیاهی دارد، که چشم‌انداز خوبی را برای کاربرد تجاری آینده آن باز می‌کند.
تمام آزمایش‌ها توسط کمیته اخلاق دانشگاه یونگنام، گیونگسان، کره تأیید شدند و روش‌ها مطابق با دستورالعمل‌های کمیته اخلاق دانشگاه یونگنام انجام شدند.
آزمایش‌های انکوباسیون تخم با استفاده از رویه‌های تعیین‌شده انجام شد43. برای ارزیابی نرخ تفریخ (HR)، نماتدهای بالغ 1 روزه (تقریباً 100 ماده و 100 نر) به پتری دیش‌های حاوی قارچ منتقل شدند و به مدت 24 ساعت اجازه رشد داده شدند. سپس تخم‌ها جدا شده و با 5-یدوایندول (0.05 میلی‌مولار و 0.1 میلی‌مولار) یا آورمکتین (10 میکروگرم در میلی‌لیتر) به صورت سوسپانسیون در آب مقطر استریل تیمار شدند. این سوسپانسیون‌ها (500 میکرولیتر؛ تقریباً 100 تخم) به چاهک‌های یک پلیت کشت بافت 24 چاهکی منتقل و در دمای 22 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. شمارش L2 پس از 24 ساعت انکوباسیون انجام شد، اما اگر سلول‌ها هنگام تحریک با یک سیم پلاتینی ظریف حرکت نمی‌کردند، مرده در نظر گرفته می‌شدند. این آزمایش در دو مرحله، هر کدام با شش تکرار انجام شد. داده‌های هر دو آزمایش ترکیب و ارائه شدند. درصد HR به شرح زیر محاسبه می‌شود:
مرگ و میر لاروها با استفاده از روش‌های از پیش توسعه‌یافته ارزیابی شد. تخم‌های نماتد جمع‌آوری و جنین‌ها با تفریخ در آب مقطر استریل برای تولید لاروهای مرحله L2 همزمان‌سازی شدند. لاروهای همزمان‌سازی شده (تقریباً 500 نماتد) با 5-یدوایندول (0.05 میلی‌مولار و 0.1 میلی‌مولار) یا آورمکتین (10 میکروگرم در میلی‌لیتر) تیمار شده و روی صفحات پتری B. cinerea پرورش داده شدند. پس از 48 ساعت انکوباسیون در دمای 22 درجه سانتیگراد، نماتدها در آب مقطر استریل جمع‌آوری و از نظر وجود مراحل L2، L3 و L4 بررسی شدند. وجود مراحل L3 و L4 نشان دهنده تغییر شکل لارو بود، در حالی که وجود مرحله L2 نشان دهنده عدم تغییر شکل بود. تصاویر با استفاده از سیستم تصویربرداری سلولی دیجیتال iRiS™ به دست آمدند. این آزمایش در دو مرحله، هر کدام با شش تکرار انجام شد. داده‌های هر دو آزمایش ترکیب و ارائه شدند.
سمیت 5-یدوایندول و آورمکتین برای بذرها با استفاده از آزمایش‌های جوانه‌زنی روی پلیت‌های آگار موراشیگ و اسکوگ ارزیابی شد.62 بذرهای B. oleracea و R. raphanistrum ابتدا به مدت یک روز در آب مقطر استریل خیسانده شدند، با 1 میلی‌لیتر اتانول 100٪ شسته شدند، با 1 میلی‌لیتر سفیدکننده تجاری 50٪ (3٪ هیپوکلریت سدیم) به مدت 15 دقیقه استریل شدند و پنج بار با 1 میلی‌لیتر آب استریل شسته شدند. سپس بذرهای استریل شده روی پلیت‌های آگار جوانه‌زنی حاوی 0.86 گرم در لیتر (0.2X) محیط کشت موراشیگ و اسکوگ و 0.7٪ آگار باکتریولوژیک با یا بدون 5-یدوایندول یا آورمکتین فشرده شدند. سپس پلیت‌ها در دمای 22 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و پس از 3 روز انکوباسیون، تصاویر گرفته شد. این آزمایش در دو مرحله انجام شد که هر کدام شش تکرار داشتند.