مکمل قارچ کش باعث کاهش انرژی خالص و تنوع میکروبیوم در زنبورهای سنگ انفرادی می شود.

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد.برای بهترین نتایج، توصیه می کنیم از نسخه جدیدتر مرورگر خود استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل یا جاوا اسکریپت نمایش می دهیم.
قارچ کش ها اغلب در هنگام گلدهی میوه درختان استفاده می شوند و می توانند گرده افشان حشرات را تهدید کنند.با این حال، اطلاعات کمی در مورد اینکه چگونه گرده افشان های غیر زنبور عسل (به عنوان مثال، زنبورهای منفرد، Osmia cornifrons) به قارچ کش های تماسی و سیستمیک که معمولاً در طول گلدهی روی سیب استفاده می شود، پاسخ می دهند.این شکاف دانش تصمیمات نظارتی را در تعیین غلظت ایمن و زمان سمپاشی قارچ کش محدود می کند.ما اثرات دو قارچ‌کش تماسی (کاپتان و مانکوزب) و چهار قارچ‌کش بین لایه‌ای/فیتوسیستم (سیپروسیکلین، مایکلوبوتانیل، پیروستروبین و تری فلوکسی استروبین) را ارزیابی کردیم.تأثیر بر افزایش وزن لارو، بقا، نسبت جنسیتی و تنوع باکتریایی.ارزیابی با استفاده از یک بیواسی مزمن خوراکی انجام شد که در آن گرده در سه دوز بر اساس دوز توصیه شده فعلی برای استفاده در مزرعه (1X)، نیم دوز (0.5X) و دوز پایین (0.1X) درمان شد.تمام دوزهای مانکوزب و پیریتیزولین به طور قابل توجهی وزن بدن و بقای لارو را کاهش دادند.سپس ژن 16S را برای مشخص کردن باکتری لارو mancozeb، قارچ کش مسئول بالاترین مرگ و میر، توالی یابی کردیم.ما دریافتیم که تنوع و فراوانی باکتری به طور قابل توجهی در لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار شده با mancozeb کاهش یافت.نتایج آزمایشگاهی ما نشان می دهد که سمپاشی برخی از این قارچ کش ها در طول گلدهی به ویژه برای سلامت O. cornifrons مضر است.این اطلاعات برای تصمیمات مدیریتی آینده در مورد استفاده پایدار از محصولات حفاظتی درختان میوه مرتبط است و به عنوان مبنایی برای فرآیندهای نظارتی با هدف حفاظت از گرده افشان ها عمل می کند.
زنبور سنگی منفرد Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) در اواخر دهه 1970 و اوایل دهه 1980 از ژاپن به ایالات متحده معرفی شد و از آن زمان تاکنون این گونه نقش گرده افشان مهمی در اکوسیستم های مدیریت شده ایفا کرده است.جمعیت طبیعی این زنبور بخشی از تقریباً 50 گونه زنبورهای وحشی هستند که مکمل زنبورهایی هستند که باغ های بادام و سیب در ایالات متحده را گرده افشانی می کنند.زنبورهای میسون با چالش های زیادی از جمله تکه تکه شدن زیستگاه، پاتوژن ها و آفت کش ها مواجه هستند.در بین حشره کش ها، قارچ کش ها باعث کاهش انرژی، جست و جوی غذا و تهویه بدن می شوند.اگرچه تحقیقات اخیر نشان می دهد که سلامت زنبورهای میسون به طور مستقیم تحت تأثیر میکروارگانیسم های مشترک و اکتوباکتیک است، 8،9 زیرا باکتری ها و قارچ ها می توانند بر تغذیه و پاسخ های ایمنی تأثیر بگذارند، تأثیر قرار گرفتن در معرض قارچ کش بر تنوع میکروبی زنبورهای میسون تازه شروع شده است. مطالعه کرد.
قارچ کش ها با اثرات مختلف (تماسی و سیستمیک) برای درمان بیماری هایی مانند دلمه سیب، پوسیدگی تلخ، پوسیدگی قهوه ای و سفیدک پودری، قبل و در هنگام گلدهی در باغات سمپاشی می شوند10،11.قارچ کش ها برای گرده افشان ها بی ضرر در نظر گرفته می شوند، بنابراین در طول دوره گلدهی به باغبان توصیه می شود.قرار گرفتن در معرض و بلع این قارچ کش ها توسط زنبورها نسبتاً شناخته شده است، زیرا بخشی از فرآیند ثبت آفت کش ها توسط آژانس حفاظت از محیط زیست ایالات متحده و بسیاری دیگر از آژانس های نظارتی ملی است.با این حال، اثرات قارچ کش ها بر روی زنبورهای غیر زنبور کمتر شناخته شده است، زیرا طبق توافق نامه های مجوز بازاریابی در ایالات متحده نیازی به آنها نیست.علاوه بر این، به طور کلی هیچ پروتکل استانداردی برای آزمایش زنبورهای منفرد16،17 وجود ندارد، و حفظ کلنی هایی که زنبورها را برای آزمایش فراهم می کنند، چالش برانگیز است.آزمایشات روی زنبورهای مختلف مدیریت شده به طور فزاینده ای در اروپا و ایالات متحده آمریکا برای مطالعه اثرات آفت کش ها بر زنبورهای وحشی انجام می شود و اخیراً پروتکل های استاندارد شده برای O. cornifrons19 ایجاد شده است.
زنبورهای شاخدار مونوسیت هستند و به صورت تجاری در محصولات کپور به عنوان مکمل یا جایگزینی برای زنبورهای عسل استفاده می شوند.این زنبورها بین ماه مارس و آوریل ظاهر می شوند و نرهای نابالغ سه تا چهار روز قبل از ماده ها ظاهر می شوند.پس از جفت گیری، ماده به طور فعال گرده و شهد را جمع آوری می کند تا یک سری سلول های نوزادی را در داخل حفره لانه لوله ای (طبیعی یا مصنوعی) فراهم کند.تخم ها روی گرده های داخل سلول گذاشته می شوند.سپس زن قبل از آماده کردن سلول بعدی یک دیوار سفالی می سازد.لاروهای سن اول در کوریون محصور شده و از مایعات جنینی تغذیه می کنند.لاروها از سن دوم تا پنجم (prepupa) از گرده تغذیه می کنند22.هنگامی که ذخایر گرده به طور کامل تمام شد، لاروها پیله تشکیل می دهند، شفیره می شوند و به صورت بالغ در اتاق بچه زایی یکسان ظاهر می شوند، معمولاً در اواخر تابستان20،23.بزرگسالان در بهار بعد ظاهر می شوند.بقای بزرگسالان با افزایش خالص انرژی (افزایش وزن) بر اساس دریافت غذا مرتبط است.بنابراین، کیفیت تغذیه گرده و همچنین عوامل دیگری مانند آب و هوا یا قرار گرفتن در معرض آفت کش ها، تعیین کننده بقا و سلامت هستند.
حشره‌کش‌ها و قارچ‌کش‌هایی که قبل از گل‌دهی به کار می‌روند، می‌توانند به درجات مختلف در عروق گیاه حرکت کنند، از ترانس لامینار (مثلاً قادر به حرکت از سطح بالایی برگ‌ها به سطح پایین، مانند برخی قارچ‌کش‌ها) تا اثرات واقعاً سیستمیک.، که می تواند از ریشه به تاج نفوذ کند، می تواند وارد شهد گل سیب شود26، جایی که می تواند O. cornifrons27 بالغ را بکشد.برخی از آفت‌کش‌ها نیز به گرده نفوذ می‌کنند و بر رشد لارو ذرت تأثیر می‌گذارند و باعث مرگ آنها می‌شوند.مطالعات دیگر نشان داده اند که برخی از قارچ کش ها می توانند به طور قابل توجهی رفتار لانه سازی گونه های مرتبط O. lignaria28 را تغییر دهند.علاوه بر این، مطالعات آزمایشگاهی و میدانی شبیه‌سازی سناریوهای مواجهه با آفت‌کش‌ها (از جمله قارچ‌کش‌ها) نشان داده‌اند که آفت‌کش‌ها بر فیزیولوژی 22 مورفولوژی 29 و بقای زنبورهای عسل و برخی زنبورهای منفرد تأثیر منفی می‌گذارند.اسپری‌های قارچ‌کش مختلف که مستقیماً روی گل‌های باز در طول گلدهی اعمال می‌شوند، ممکن است گرده‌های جمع‌آوری‌شده توسط بزرگسالان برای رشد لارو را آلوده کنند، که اثرات آن هنوز مورد مطالعه قرار دارد.
به طور فزاینده ای تشخیص داده می شود که رشد لارو تحت تأثیر گرده ها و جوامع میکروبی دستگاه گوارش است.میکروبیوم زنبور عسل بر پارامترهایی مانند توده بدن31، تغییرات متابولیک22 و حساسیت به پاتوژن ها تأثیر می گذارد.مطالعات قبلی تأثیر مرحله رشد، مواد مغذی و محیط را بر میکروبیوم زنبورهای منفرد بررسی کرده اند.این مطالعات شباهت‌هایی را در ساختار و فراوانی میکروبیوم‌های لارو و گرده و همچنین رایج‌ترین جنس‌های باکتریایی Pseudomonas و Delftia در میان گونه‌های منفرد زنبور عسل نشان داد.با این حال، اگرچه قارچ‌کش‌ها با استراتژی‌هایی برای محافظت از سلامت زنبور عسل همراه شده‌اند، اما اثرات قارچ‌کش‌ها بر میکروبیوتای لارو از طریق قرار گرفتن در معرض مستقیم خوراکی ناشناخته باقی می‌ماند.
این مطالعه اثرات دوزهای واقعی شش قارچ‌کش رایج مورد استفاده را که برای استفاده بر روی میوه درختان در ایالات متحده ثبت شده‌اند، از جمله قارچ‌کش‌های تماسی و سیستمیک که به صورت خوراکی به لارو پروانه کرم شاخک ذرت از غذای آلوده تجویز می‌شوند، آزمایش کرد.ما دریافتیم که قارچ کش های تماسی و سیستمیک باعث کاهش افزایش وزن زنبور عسل و افزایش مرگ و میر می شوند که شدیدترین اثرات مربوط به مانکوزب و پیریتیوپید است.سپس تنوع میکروبی لاروهایی را که از جیره گرده تیمار شده با مانکوزب تغذیه شده بودند با آنهایی که از جیره شاهد تغذیه می شدند، مقایسه کردیم.ما مکانیسم های بالقوه زیربنایی مرگ و میر و پیامدهای برنامه های مدیریت یکپارچه آفات و گرده افشان (IPPM)36 را مورد بحث قرار می دهیم.
بزرگسالان O. cornifrons زمستان گذرانی در پیله از مرکز تحقیقات میوه، Biglerville، PA، به دست آمد، و در دمای -3 تا 2 درجه سانتی گراد (± 0.3 درجه سانتی گراد) ذخیره شده است.قبل از آزمایش (در مجموع 600 پیله).در ماه مه 2022، روزانه 100 پیله O. cornifrons به فنجان های پلاستیکی (50 پیله در هر فنجان، DI 5 سانتی متر × 15 سانتی متر طول) انتقال داده شد و دستمال مرطوب در داخل فنجان ها قرار داده شد تا باز شدن را بهبود بخشد و بستری قابل جویدن ایجاد کند و استرس را بر روی سنگ کاهش دهد. زنبورها 37 .دو فنجان پلاستیکی حاوی پیله را در یک قفس حشره (30 × 30 × 30 سانتی متر، BugDorm MegaView Science Co. Ltd., Taiwan) با فیدرهای 10 میلی لیتری حاوی محلول 50 درصد ساکارز قرار دهید و برای اطمینان از بسته شدن و جفت شدن به مدت چهار روز نگهداری کنید.23 درجه سانتی گراد، رطوبت نسبی 60 درصد، دوره نوری 10 لیتر (شدت کم): 14 روز.100 ماده و نر جفت شده هر روز صبح به مدت شش روز (100 عدد در روز) در طول اوج گلدهی سیب در دو لانه مصنوعی رها می شدند (لانه تله: عرض 33.66 × ارتفاع 30.48 × طول 46.99 سانتی متر؛ شکل تکمیلی 1).در درختکاری ایالت پنسیلوانیا، نزدیک گیلاس (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™)، هلو (Prunus persica 'Contender')، Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®)، گلابی (Pyrus perifolia 'Olympic'، Pyrus perifolia 'Shinko'، Pyrus perifolia 'Shinseiki')، درخت سیب coronaria (Malus coronaria) و انواع متعددی از درختان سیب (Malus coronaria، Malus)، درخت سیب خانگی 'Co-op 30' Enterprise™، Malus apple tree 'Co- Op 31' Winecrisp™، بگونیا "Freedom"، Begonia "Golden Delicious"، Begonia "Nova Spy").هر پرنده پلاستیکی آبی روی دو جعبه چوبی قرار می گیرد.هر جعبه لانه حاوی 800 لوله خالی کاغذ کرافت (مارپیچ باز، 0.8 سانتی متر ID × 15 سانتی متر L) (Jonesville Paper Tube Co.، میشیگان) قرار داده شده در لوله های سلفون مات (0.7 OD مراجعه کنید به شاخه های پلاستیکی (شاخه های T-1X) مکان های تودرتو را فراهم می کند. .
هر دو جعبه لانه رو به شرق بوده و برای جلوگیری از دسترسی جوندگان و پرندگان با حصار باغ پلاستیکی سبز رنگ (Everbilt مدل #889250EB12، اندازه دهانه 5 × 5 سانتی متر، 0.95 متر × 100 متر) پوشانده شده و روی سطح خاک در کنار خاک جعبه لانه قرار داده شده است. جعبه ها.جعبه آشیانه (شکل تکمیلی 1a).تخم‌های حشره‌خوار ذرت روزانه با جمع‌آوری 30 لوله از لانه و انتقال به آزمایشگاه جمع‌آوری شد.با استفاده از قیچی، یک برش در انتهای لوله ایجاد کنید، سپس لوله مارپیچی را جدا کنید تا سلول های مولد در معرض دید قرار گیرند.تخم‌ها و گرده‌های آن‌ها با استفاده از یک کاردک منحنی (کیت ابزار Microslide، BioQuip Products Inc.، کالیفرنیا) حذف شدند.تخم‌ها روی کاغذ صافی مرطوب انکوبه شدند و قبل از استفاده در آزمایشات ما به مدت 2 ساعت در ظرف پتری قرار داده شدند (شکل تکمیلی 1b-d).
در آزمایشگاه، ما سمیت خوراکی شش قارچ‌کش را که قبل و در طول شکوفه‌های سیب استفاده می‌شد، در سه غلظت (0.1X، 0.5X و 1X، که در آن 1X علامتی است که در هر 100 گالن آب در هکتار استفاده می‌شود، ارزیابی کردیم. دوز مزرعه بالا = غلظت. در زمینه).، میز 1).هر غلظت 16 بار (16 نفر) تکرار شد.دو قارچ کش تماسی (جدول S1: mancozeb 2696.14 ppm و captan 2875.88 ppm) و چهار قارچ کش سیستمیک (جدول S1: pyrithiostrobin 250.14 ppm؛ trifloxystrobin 110.06 ppm؛ myclobutanil azole ppm میوه ها، سبزیجات و محصولات زینتی .گرده ها را با استفاده از آسیاب همگن کردیم، 0.20 گرم را به یک چاه (فالکن 24 چاهی) منتقل کردیم و 1 میکرولیتر محلول قارچ کش را اضافه و مخلوط کردیم تا گرده هرمی شکل با چاه هایی به عمق 1 میلی متر که تخم ها در آن قرار می گرفتند، تشکیل شود.با استفاده از یک کاردک کوچک قرار دهید (شکل تکمیلی 1c,d).صفحات فالکون در دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد) و رطوبت نسبی 70 درصد نگهداری شدند.ما آنها را با لاروهای کنترل تغذیه شده با یک جیره گرده همگن تیمار شده با آب خالص مقایسه کردیم.ما مرگ و میر را ثبت کردیم و وزن لارو را یک روز در میان اندازه گرفتیم تا زمانی که لاروها به سن پیش شفیرگی با استفاده از یک تعادل تحلیلی (فیشر علمی، دقت = 0.0001 گرم) رسیدند.در نهایت نسبت جنسی با باز کردن پیله بعد از 2.5 ماه ارزیابی شد.
DNA از کل لارو O. cornifrons (n ​​= 3 در هر شرایط تیمار، گرده تیمار شده با mancozeb و گرده تیمار نشده) استخراج شد و ما تجزیه و تحلیل تنوع میکروبی را بر روی این نمونه ها انجام دادیم، به خصوص اینکه در mancozeb بیشترین مرگ و میر در لارو مشاهده شد.دریافت MnZnDNA تکثیر شد، با استفاده از کیت DNA MagBead DNAZymoBIOMICS®-96 (Zymo Research, Irvine, CA) خالص شد و (600 چرخه) روی یک Illumina® MiSeq™ با استفاده از کیت v3 تعیین توالی شد.توالی یابی هدفمند ژن های RNA ریبوزومی 16S باکتریایی با استفاده از کیت آماده سازی کتابخانه Quick-16S™ NGS (Zymo Research, Irvine, CA) با استفاده از پرایمرهایی که ناحیه V3-V4 ژن 16S rRNA را هدف قرار می دهند، انجام شد.علاوه بر این، توالی یابی 18S با استفاده از گنجاندن 10 درصد PhiX و تقویت با استفاده از جفت پرایمر 18S001 و NS4 انجام شد.
با استفاده از خط لوله QIIME2 (v2022.11.1)، خواندن های جفت شده 39 را وارد و پردازش کنید.این قرائت‌ها بریده شده و ادغام شدند و توالی‌های کایمریک با استفاده از افزونه DADA2 در QIIME2 (qiime dada2 noise pairing)40 حذف شدند.تکالیف کلاس 16S و 18S با استفاده از پلاگین طبقه‌بندی شی Classify-sklearn و طبقه‌بندی‌کننده artifact silva-138-99-nb از پیش آموزش‌دیده انجام شد.
تمام داده های تجربی از نظر نرمال بودن (شاپیرو-ویلکز) و همگنی واریانس ها (آزمون لوون) بررسی شدند.از آنجایی که مجموعه داده ها با مفروضات تحلیل پارامتریک مطابقت نداشت و تبدیل در استانداردسازی باقیمانده ها شکست خورد، ما یک آنالیز واریانس دو طرفه ناپارامتریک (Kruskal-Wallis) با دو عامل [زمان (سه فاز 2، 5 و 8 روزه) انجام دادیم. نقاط زمانی) و قارچ کش] برای ارزیابی اثر تیمار بر وزن تر لارو، سپس مقایسات زوجی ناپارامتریک تعقیبی با استفاده از آزمون Wilcoxon انجام شد.ما از یک مدل خطی تعمیم‌یافته (GLM) با توزیع پواسون برای مقایسه اثرات قارچ‌کش‌ها بر بقا در سه غلظت قارچ‌کش ۴۱،۴۲ استفاده کردیم.برای تجزیه و تحلیل فراوانی دیفرانسیل، تعداد انواع توالی آمپلیکون (ASVs) در سطح جنس جمع شد.مقایسه فراوانی دیفرانسیل بین گروه‌ها با استفاده از فراوانی نسبی 16S (سطح جنس) و 18S با استفاده از یک مدل افزایشی تعمیم‌یافته برای موقعیت، مقیاس و شکل (GAMLSS) با توزیع‌های خانواده با باد صفر (BEZI) انجام شد که بر روی یک ماکرو مدل‌سازی شدند. .در Microbiome R43 (v1.1).1).قبل از تجزیه و تحلیل افتراقی، گونه های میتوکندری و کلروپلاست را حذف کنید.به دلیل سطوح مختلف طبقه بندی 18S، تنها از پایین ترین سطح هر تاکسون برای تحلیل های افتراقی استفاده شد.تمام تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از R (نسخه 3.4.3.، پروژه CRAN) (تیم 2013) انجام شد.
قرار گرفتن در معرض mancozeb، pyrithiostrobin، و trifloxystrobin به طور قابل توجهی افزایش وزن بدن را در O. cornifrons کاهش داد (شکل 1).این اثرات به طور مداوم برای هر سه دوز ارزیابی شده مشاهده شد (شکل 1a-c).سیکلوستروبین و مایکلوبوتانیل وزن لارو را به میزان قابل توجهی کاهش ندادند.
میانگین وزن تازه لارو کرم ساقه خوار در سه نقطه زمانی تحت چهار تیمار جیره (خوراک گرده همگن + قارچ کش: شاهد، 0.1X، 0.5X و 1X دوز) اندازه گیری شد.(الف) دوز پایین (0.1X): نقطه زمان اول (روز 1): χ2: 30.99، DF = 6.P <0.0001، نقطه زمان دوم (روز 5): 22.83، DF = 0.0009;دفعه سوم؛نقطه (روز 8): χ2: 28.39، DF = 6;(ب) نصف دوز (0.5X): اولین زمان (روز 1): χ2: 35.67، DF = 6.P <0.0001، نقطه زمان دوم (روز اول).): χ2: 15.98، DF = 6;P = 0.0090;نقطه زمانی سوم (روز 8) χ2: 16.47، DF = 6.(ج) محل یا دوز کامل (1X): نقطه زمان اول (روز 1) χ2: 20.64، P = 6.P = 0.0326، نقطه زمان دوم (روز 5): χ2: 22.83، DF = 6;P = 0.0009;نقطه زمانی سوم (روز 8): χ2: 28.39، DF = 6;تحلیل واریانس ناپارامتریکمیله‌ها میانگین ± SE مقایسه‌های زوجی را نشان می‌دهند (05/0 = α) (16=n) *05/0 ≤ P، 001/0 ≤ P، 0001/0 ≤ P ***.
در کمترین دوز (0.1X)، وزن بدن لارو با تری فلوکسی استروبین 60 درصد، مانکوزب 49 درصد، مایکلوبوتانیل 48 درصد و پیریتیستروبین 46 درصد کاهش یافت (شکل 1a).هنگامی که در معرض نصف دوز مزرعه (0.5X)، وزن بدن لارو مانکوزب 86 درصد، پیریتیوستروبین تا 52 درصد و تری فلوکسی استروبین تا 50 درصد کاهش یافت (شکل 1b).دوز کامل میدانی (1X) مانکوزب وزن لارو را 82 درصد، پیریتیوستروبین را 70 درصد و تری فلوکسی استروبین، مایکلوبوتانیل و سنگارد را تقریباً 30 درصد کاهش داد (شکل 1c).
مرگ و میر در میان لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار شده با مانکوزب و به دنبال آن پیریتیوستروبین و تری فلوکسی استروبین بالاترین میزان بود.مرگ و میر با افزایش دوزهای مانکوزب و پیریتیزولین افزایش یافت (شکل 2؛ جدول 2).با این حال، مرگ و میر کرمخوار ذرت تنها کمی افزایش یافته است به عنوان غلظت تری فلوکسی استروبین افزایش یافته است.سیپرودینیل و کاپتان مرگ و میر را در مقایسه با تیمارهای شاهد افزایش معنی داری نداشتند.
مرگ و میر لارو مگس کرم خوار پس از مصرف گرده به صورت جداگانه تحت درمان با شش قارچ کش مختلف مقایسه شد.مانکوزب و پنتوپیرامید به قرار گرفتن در معرض خوراکی با ماگت ذرت حساس‌تر بودند (GLM: χ = 29.45، DF = 20، P = 0.0059) (خط، شیب = 0.29، P <0.001، شیب = 0.24، P <0).
به طور متوسط ​​در تمامی درمان ها 05/39 درصد بیماران زن و 95/60 درصد مرد بودند.در میان تیمارهای شاهد، نسبت زنان در هر دو مطالعه با دوز کم (0.1X) و نیم دوز (0.5X) 40 درصد و در مطالعات دوز میدانی (1X) 30 درصد بود.در دوز 0.1X، در بین لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار شده با مانکوزب و مایکلوبوتانیل، 33.33% از بالغین ماده، 22% بالغین ماده، 44% لاروهای بالغ ماده، 44% لاروهای بالغ ماده بودند.ماده، 41 درصد لاروهای بالغ ماده بودند و شاهد 31 درصد (شکل 3a).با 0.5 برابر دوز، 33 درصد از کرم های بالغ در گروه مانکوزب و پیریتیوستروبین ماده، 36 درصد در گروه تری فلوکسی استروبین، 41 درصد در گروه مایکلوبوتانیل و 46 درصد در گروه سیپروستروبین بودند.این رقم در گروه 53 درصد بود.در گروه کاپتان و 38 درصد در گروه کنترل (شکل 3 ب).در دوز 1X، 30٪ از گروه مانکوزب زن، 36٪ از گروه پیریتیوستروبین، 44٪ از گروه تری فلوکسی استروبین، 38٪ از گروه مایکلوبوتانیل، 50٪ از گروه کنترل زن بودند - 38.5٪ (شکل 3c) .
درصد حشرات ماده و نر پس از قرار گرفتن در معرض قارچ کش مرحله لاروی.(الف) دوز پایین (0.1X).(ب) نصف دوز (0.5X).(ج) دوز میدانی یا دوز کامل (1X).
تجزیه و تحلیل توالی 16S نشان داد که گروه باکتری بین لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار شده با مانکوزب و لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار نشده تفاوت دارد (شکل 4a).شاخص میکروبی لاروهای تیمار نشده تغذیه شده با گرده بیشتر از لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار شده با مانکوزب بود (شکل 4b).اگرچه تفاوت مشاهده شده در غنای بین گروه ها از نظر آماری معنی دار نبود، اما به طور قابل توجهی کمتر از مشاهده شده برای لاروهای تغذیه شده از گرده های تیمار نشده بود (شکل 4c).فراوانی نسبی نشان داد که میکروبیوتای لاروهای تغذیه شده با گرده شاهد نسبت به لاروهای تغذیه شده با لاروهای تیمار شده با مانکوزب متنوع تر بود (شکل 5a).تجزیه و تحلیل توصیفی حضور 28 جنس را در نمونه های شاهد و تیمار شده با مانکوزب نشان داد (شکل 5b).ج تجزیه و تحلیل با استفاده از توالی یابی 18S تفاوت معنی داری را نشان نداد (شکل تکمیلی 2).
پروفایل های SAV بر اساس توالی های 16S با غنای شانون مقایسه شد و غنا در سطح شاخه مشاهده شد.(الف) تجزیه و تحلیل مختصات اصلی (PCoA) بر اساس ساختار کلی جامعه میکروبی در لاروهای تغذیه نشده با گرده یا شاهد (آبی) و لاروهای تغذیه شده با مانکوزب (نارنجی).هر نقطه داده نشان دهنده یک نمونه جداگانه است.PCoA با استفاده از فاصله Bray-Curtis از توزیع t چند متغیره محاسبه شد.بیضی ها سطح اطمینان 80% را نشان می دهند.(ب) باکس‌پلات، داده‌های خام شانون ثروت (امتیاز) و ج.ثروت قابل مشاهدهنمودارهای جعبه جعبه هایی را برای خط میانه، محدوده بین چارکی (IQR) و 1.5 × IQR (n = 3) نشان می دهند.
ترکیب جوامع میکروبی لارو تغذیه شده از گرده تیمار شده با مانکوزب و گرده تیمار نشده(الف) فراوانی نسبی جنس‌های میکروبی در لاروها مشاهده می‌شود.(ب) نقشه حرارتی جوامع میکروبی شناسایی شده.دلفتیا (نسبت شانس (OR) = 0.67، P = 0.0030) و سودوموناس (OR = 0.3، P = 0.0074)، میکروباکتریوم (OR = 0.75، P = 0.0617) (OR = 1.5، P = 0.0060).ردیف‌های نقشه حرارتی با استفاده از فاصله همبستگی و اتصال متوسط ​​خوشه‌بندی می‌شوند.
نتایج ما نشان می دهد که قرار گرفتن در معرض خوراکی با قارچ کش های تماسی (مانکوزب) و سیستمیک (پیروستروبین و تری فلوکسی استروبین) که به طور گسترده در طول گلدهی استفاده می شود، افزایش وزن را به طور قابل توجهی کاهش داده و مرگ و میر لارو ذرت را افزایش می دهد.علاوه بر این، مانکوزب به طور قابل توجهی تنوع و غنای میکروبیوم را در مرحله پیش از شفیرگی کاهش داد.مایکلوبوتانیل، یکی دیگر از قارچ کش های سیستمیک، به طور قابل توجهی افزایش وزن بدن لارو را در هر سه دوز کاهش داد.این اثر در نقاط زمانی دوم (روز 5) و سوم (روز 8) مشهود بود.در مقابل، سیپرودینیل و کاپتان به طور قابل توجهی افزایش وزن یا بقا را در مقایسه با گروه کنترل کاهش ندادند.با توجه به دانش ما، این کار اولین کاری است که اثرات نرخ مزرعه قارچ کش های مختلف مورد استفاده برای محافظت از محصولات ذرت را از طریق قرار گرفتن در معرض مستقیم گرده تعیین می کند.
تمام تیمارهای قارچ کش به طور قابل توجهی افزایش وزن بدن را در مقایسه با تیمارهای شاهد کاهش دادند.Mancozeb با میانگین کاهش 51 درصدی بیشترین تأثیر را بر افزایش وزن بدن لارو داشت و پس از آن پیریتیوستروبین قرار گرفت.با این حال، سایر مطالعات اثرات نامطلوب دوزهای مزرعه ای قارچ کش ها را بر مراحل لارو گزارش نکرده اند.اگرچه نشان داده شده است که بیوسیدهای دی تیوکاربامات سمیت حاد کمی دارند، اما بیس دی تیوکاربامات های اتیلن (EBDCS) مانند مانکوزب می توانند به اوره اتیلن سولفید تجزیه شوند.با توجه به اثرات جهش زایی آن در سایر حیوانات، این محصول تخریب ممکن است مسئول اثرات مشاهده شده باشد46،47.مطالعات قبلی نشان داده است که تشکیل اتیلن تیوره تحت تأثیر عواملی مانند افزایش دما48، سطوح رطوبت49 و طول مدت نگهداری محصول است.شرایط نگهداری مناسب برای بیوسیدها می تواند این عوارض جانبی را کاهش دهد.علاوه بر این، سازمان ایمنی غذای اروپا نگرانی خود را در مورد سمیت پیریتیوپید، که نشان داده شده است برای سیستم گوارشی سایر حیوانات سرطان زا است، ابراز کرده است.
مصرف خوراکی مانکوزب، پیریتیوستروبین و تری فلوکسی استروبین باعث افزایش مرگ و میر لاروهای کرمخوار ذرت می شود.در مقابل، مایکلوبوتانیل، سیپروسیکلین و کاپتان هیچ تاثیری بر مرگ و میر نداشتند.این نتایج با نتایج Ladurner و همکاران 52 متفاوت است، که نشان داد کاپتان به طور قابل توجهی بقای O. lignaria بالغ و Apis mellifera L. (Hymenoptera، Apisidae) را کاهش داد.علاوه بر این، قارچ‌کش‌هایی مانند کاپتان و بوسکالید باعث مرگ و میر لاروها می‌شوند یا رفتار تغذیه‌ای را تغییر می‌دهند.این تغییرات به نوبه خود می تواند بر کیفیت تغذیه گرده و در نهایت افزایش انرژی مرحله لاروی تأثیر بگذارد.مرگ و میر مشاهده شده در گروه کنترل با سایر مطالعات 56،57 مطابقت داشت.
نسبت جنسی مطلوب نر مشاهده شده در کار ما ممکن است با عواملی مانند جفت گیری ناکافی و شرایط آب و هوایی نامناسب در طول گلدهی توضیح داده شود، همانطور که قبلا برای O. cornuta توسط Vicens و Bosch پیشنهاد شده بود.اگرچه ماده ها و نرها در مطالعه ما چهار روز برای جفت گیری وقت داشتند (دوره ای که عموماً برای جفت گیری موفق کافی در نظر گرفته می شود)، ما عمداً شدت نور را کاهش دادیم تا استرس را به حداقل برسانیم.با این حال، این اصلاح ممکن است به طور ناخواسته در فرآیند جفت گیری تداخل ایجاد کند61.علاوه بر این، زنبورها چندین روز آب و هوای نامطلوب از جمله باران و دمای پایین (<5 درجه سانتیگراد) را تجربه می کنند، که می تواند بر موفقیت جفت گیری تأثیر منفی بگذارد.
اگرچه مطالعه ما بر روی کل میکروبیوم لارو متمرکز بود، اما نتایج ما بینشی در مورد روابط بالقوه بین جوامع باکتریایی ارائه می دهد که ممکن است برای تغذیه زنبورها و قرار گرفتن در معرض قارچ کش حیاتی باشد.به عنوان مثال، لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار شده با مانکوزب در مقایسه با لاروهایی که با گرده تیمار نشده تغذیه شده بودند، ساختار و فراوانی جامعه میکروبی را به طور قابل توجهی کاهش دادند.در لاروهایی که گرده تیمار نشده مصرف می‌کردند، گروه‌های باکتریایی پروتئوباکتریا و اکتینوباکتریا غالب بودند و عمدتاً هوازی یا هوازی اختیاری بودند.باکتری دلفت که معمولاً با گونه های زنبور منفرد مرتبط است، دارای فعالیت آنتی بیوتیکی است که نشان دهنده نقش محافظتی بالقوه در برابر عوامل بیماری زا است.گونه باکتری دیگری، سودوموناس، در لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار نشده فراوان بود، اما در لاروهای تیمار شده با مانکوزب به میزان قابل توجهی کاهش یافت.نتایج ما از مطالعات قبلی حمایت می‌کند که سودوموناس را به‌عنوان یکی از فراوان‌ترین جنس‌ها در O. bicornis35 و دیگر زنبورهای منفرد شناسایی کرده‌اند.اگرچه شواهد تجربی برای نقش سودوموناس در سلامت O. cornifrons مورد مطالعه قرار نگرفته است، اما نشان داده شده است که این باکتری سنتز سموم محافظ را در سوسک Paederus fuscipes ترویج می کند و متابولیسم آرژنین را در شرایط آزمایشگاهی 35، 65 ارتقا می دهد. این مشاهدات نشان می دهد. نقش بالقوه در دفاع ویروسی و باکتریایی در طول زمان رشد لارو O. cornifrons.میکروباکتریوم یکی دیگر از جنسهای شناسایی شده در مطالعه ما است که در لاروهای مگس سرباز سیاه در شرایط گرسنگی به تعداد زیاد وجود دارد.در لاروهای O. cornifrons، میکروباکتری ها ممکن است به تعادل و انعطاف پذیری میکروبیوم روده در شرایط استرس کمک کنند.علاوه بر این، Rhodococcus در لارو O. cornifrons یافت می شود و به دلیل توانایی های سم زدایی خود شناخته شده است.این جنس در روده A. florea نیز یافت می شود، اما به فراوانی بسیار کم68.نتایج ما وجود تنوع‌های ژنتیکی متعدد در گونه‌های میکروبی متعددی را نشان می‌دهد که می‌تواند فرآیندهای متابولیک را در لارو تغییر دهد.با این حال، درک بهتری از تنوع عملکردی O. cornifrons مورد نیاز است.
به طور خلاصه، نتایج حاکی از آن است که مانکوزب، پیریتیوستروبین و تری فلوکسی استروبین باعث کاهش افزایش وزن بدن و افزایش مرگ و میر لاروهای کرمخوار ذرت شدند.اگرچه نگرانی فزاینده ای در مورد اثرات قارچ کش ها بر گرده افشان ها وجود دارد، اما نیاز به درک بهتر اثرات متابولیت های باقیمانده این ترکیبات وجود دارد.این نتایج را می توان در توصیه هایی برای برنامه های مدیریت یکپارچه گرده افشان گنجاند که به کشاورزان کمک می کند تا از استفاده از قارچ کش های خاص قبل و در طول گلدهی درختان میوه با انتخاب قارچ کش ها و تغییر زمان کاربرد، یا با تشویق به استفاده از جایگزین های کم ضررتر اجتناب کنند. برای توسعه توصیه ها مهم است.در مورد استفاده از آفت کش ها، مانند تنظیم برنامه های سمپاشی موجود و تغییر زمان اسپری در هنگام انتخاب قارچ کش ها یا ترویج استفاده از جایگزین های کم خطرتر.تحقیقات بیشتری در مورد اثرات نامطلوب قارچ‌کش‌ها بر نسبت جنسی، رفتار تغذیه، میکروبیوم روده و مکانیسم‌های مولکولی زیربنایی کاهش وزن و مرگ و میر کرم‌های قارچ ذرت مورد نیاز است.
داده های منبع 1، 2 و 3 در شکل های 1 و 2 در مخزن داده figshare DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 و https://doi.org/10.6084/m9 ذخیره شده است.figshare.24996233.توالی های تجزیه و تحلیل شده در مطالعه فعلی (شکل 4، 5) در مخزن NCBI SRA با شماره دسترسی PRJNA1023565 موجود است.
Bosch, J. and Kemp, WP توسعه و استقرار گونه های زنبور عسل به عنوان گرده افشان محصولات کشاورزی: ​​نمونه ای از جنس Osmia.(Hymenoptera: Megachilidae) و درختان میوه.گاو نرنه بیشترمنبع92، 3-16 (2002).
پارکر، ام جی و همکارانشیوه های گرده افشانی و درک گرده افشان های جایگزین در میان پرورش دهندگان سیب در نیویورک و پنسیلوانیا.به روز رسانی.کشاورزی.سیستم های غذایی35، 1-14 (2020).
Koch I.، Lonsdorf EW، Artz DR، Pitts-Singer TL و Ricketts TH اکولوژی و اقتصاد گرده افشانی بادام با استفاده از زنبورهای بومی.جی اقتصاد.نه بیشتر111، 16-25 (2018).
لی، ای.، او، ی.، و پارک، ی.-ال.اثرات تغییر آب و هوا بر فنولوژی تراگوپان: پیامدهایی برای مدیریت جمعیت.بالا رفتن.تغییر 150، 305–317 (2018).
Artz، DR و Pitts-Singer، TL اثر قارچ کش و اسپری کمکی بر رفتار لانه سازی دو زنبور منفرد مدیریت شده (Osmia lignaria و Megachile rotundata).PloS One 10, e0135688 (2015).
Beauvais, S. et al.یک قارچ کش گیاهی با سمیت کم (فنبوکونازول) با سیگنال های کیفیت تولیدمثلی نر تداخل می کند و در نتیجه موفقیت جفت گیری را در زنبورهای منفرد وحشی کاهش می دهد.J. Apps.بوم شناسی.59، 1596-1607 (2022).
Sgolastra F. et al.حشره کش های نئونیکوتینوئید و بیوسنتز ارگوسترول مرگ و میر قارچ کش های هم افزایی را در سه گونه زنبور سرکوب می کنند.کنترل آفات.علم.73، 1236-1243 (2017).
Kuhneman JG، Gillung J، Van Dyck MT، Fordyce RF.و لارو زنبور انفرادی Danforth BN تنوع باکتریایی عرضه شده توسط گرده به زنبورهای ساقه‌دار Osmia cornifrons (Megachilidae) را تغییر می‌دهند.جلومیکروارگانیسم13, 1057626 (2023).
Dharampal PS، Danforth BN و Steffan SA میکروارگانیسم‌های ectosymbiotic در گرده تخمیر شده به اندازه خود گرده برای رشد زنبورهای منفرد مهم هستند.بوم شناسی.سیر تکاملی.12. e8788 (2022).
Kelderer M، Manici LM، Caputo F و Thalheimer M. کاشت بین ردیفی در باغ‌های سیب برای کنترل بیماری‌های بذرپاشی: مطالعه اثربخشی عملی بر اساس شاخص‌های میکروبی.خاک گیاهی 357، 381-393 (2012).
Martin PL، Kravchik T.، Khodadadi F.، Achimovich SG و Peter KA پوسیدگی تلخ سیب در میانه اقیانوس اطلس ایالات متحده: ارزیابی گونه های عامل و تأثیر شرایط آب و هوایی منطقه و حساسیت رقم.Phytopathology 111، 966-981 (2021).
کالن ام جی، تامپسون ال جی، کارولان جی کی، استوت جی کی.و Stanley DA قارچ کش ها، علف کش ها و زنبور عسل: بررسی سیستماتیک تحقیقات و روش های موجود.PLoS One 14, e0225743 (2019).
Pilling، ED و Jepson، PC اثرات هم افزایی قارچ کش های EBI و حشره کش های پیرتروئید روی زنبورهای عسل (Apis mellifera).علم را آفت می زند39، 293-297 (1993).
Mussen, EC, Lopez, JE and Peng, CY اثر قارچ‌کش‌های انتخابی بر رشد و نمو لارو زنبور عسل Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae).چهار شنبه.نه بیشتر33, 1151-1154 (2004).
ون دایک، ام.، مولن، ای.، ویکستد، دی، و مک آرت، اس. راهنمای تصمیم گیری برای استفاده از آفت کش ها برای محافظت از گرده افشان ها در باغ های درختی (دانشگاه کرنل، 2018).
Iwasaki, JM and Hogendoorn, K. قرار گرفتن در معرض زنبورها با آفت کش ها: بررسی روش ها و نتایج گزارش شده.کشاورزی.زیست بوم.چهار شنبه.314, 107423 (2021).
Kopit AM، Klinger E، Cox-Foster DL، Ramirez RA.و Pitts-Singer TL اثر نوع عرضه و قرار گرفتن در معرض آفت کش بر رشد لارو Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae).چهار شنبه.نه بیشتر51، 240-251 (2022).
Kopit AM و Pitts-Singer TL مسیرهای قرار گرفتن در معرض آفت کش ها با زنبورهای منفرد لانه خالی.چهار شنبه.نه بیشتر47، 499-510 (2018).
Pan، NT و همکاران.یک پروتکل زیست سنجی جدید برای ارزیابی سمیت آفت‌کش‌ها در زنبورهای باغبانی ژاپنی (Osmia cornifrons).علم.گزارش‌های 10, 9517 (2020).