مکمل قارچ‌کش، افزایش انرژی خالص و تنوع میکروبیوم را در زنبورهای میسون انفرادی کاهش می‌دهد.

از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین نتیجه، توصیه می‌کنیم از نسخه جدیدتر مرورگر خود استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل یا جاوا اسکریپت نمایش می‌دهیم.
قارچ‌کش‌ها اغلب در طول گلدهی میوه درختان استفاده می‌شوند و می‌توانند حشرات گرده افشان را تهدید کنند. با این حال، اطلاعات کمی در مورد چگونگی واکنش گرده افشان‌های غیر زنبوری (به عنوان مثال، زنبورهای انفرادی، Osmia cornifrons) به قارچ‌کش‌های تماسی و سیستمیک که معمولاً در طول گلدهی روی سیب استفاده می‌شوند، وجود دارد. این شکاف دانش، تصمیمات نظارتی را در تعیین غلظت‌های ایمن و زمان پاشش قارچ‌کش محدود می‌کند. ما اثرات دو قارچ‌کش تماسی (کاپتان و مانکوزب) و چهار قارچ‌کش بین لایه‌ای/سیستم گیاهی (سیپروسایکلین، میکلوبوتانیل، پیروستروبین و تریفلوکسی استروبین) را ارزیابی کردیم. اثرات بر افزایش وزن لارو، بقا، نسبت جنسی و تنوع باکتریایی. ارزیابی با استفاده از یک زیست‌سنجی خوراکی مزمن انجام شد که در آن گرده در سه دوز بر اساس دوز توصیه شده فعلی برای استفاده در مزرعه (1X)، نصف دوز (0.5X) و دوز پایین (0.1X) تیمار شد. همه دوزهای مانکوزب و پیریتیسولین به طور قابل توجهی وزن بدن و بقای لارو را کاهش دادند. سپس ژن 16S را برای توصیف باکتریوم لاروی مانکوزب، قارچ‌کش مسئول بالاترین میزان مرگ و میر، توالی‌یابی کردیم. ما دریافتیم که تنوع و فراوانی باکتری‌ها در لاروهایی که از گرده‌های تیمار شده با مانکوزب تغذیه شده‌اند، به طور قابل توجهی کاهش یافته است. نتایج آزمایشگاهی ما نشان می‌دهد که اسپری کردن برخی از این قارچ‌کش‌ها در طول گلدهی به ویژه برای سلامت O. cornifrons مضر است. این اطلاعات برای تصمیمات مدیریتی آینده در مورد استفاده پایدار از محصولات محافظت از درختان میوه مرتبط است و به عنوان پایه‌ای برای فرآیندهای نظارتی با هدف محافظت از گرده افشان‌ها عمل می‌کند.
زنبور عسل انفرادی میسون Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) در اواخر دهه 1970 و اوایل دهه 1980 از ژاپن به ایالات متحده معرفی شد و این گونه از آن زمان نقش گرده افشانی مهمی در اکوسیستم‌های مدیریت شده ایفا کرده است. جمعیت‌های طبیعی این زنبور بخشی از تقریباً 50 گونه زنبور وحشی هستند که مکمل زنبورهایی هستند که باغ‌های بادام و سیب را در ایالات متحده گرده افشانی می‌کنند2،3. زنبورهای میسون با چالش‌های زیادی از جمله تکه تکه شدن زیستگاه، عوامل بیماری‌زا و آفت‌کش‌ها3،4 روبرو هستند. در میان حشره‌کش‌ها، قارچ‌کش‌ها باعث کاهش انرژی دریافتی، جستجوی غذا5 و تهویه بدن6،7 می‌شوند. اگرچه تحقیقات اخیر نشان می‌دهد که سلامت زنبورهای میسون مستقیماً تحت تأثیر میکروارگانیسم‌های همزیست و برون‌زیست قرار دارد،8،9 زیرا باکتری‌ها و قارچ‌ها می‌توانند بر تغذیه و پاسخ‌های ایمنی تأثیر بگذارند، اما اثرات قرار گرفتن در معرض قارچ‌کش‌ها بر تنوع میکروبی زنبورهای میسون تازه شروع به مطالعه کرده است.
قارچ‌کش‌هایی با اثرات مختلف (تماسی و سیستمیک) قبل و در طول گلدهی در باغ‌ها اسپری می‌شوند تا بیماری‌هایی مانند لکه سیاه سیب، پوسیدگی تلخ، پوسیدگی قهوه‌ای و کپک پودری را درمان کنند10،11. قارچ‌کش‌ها برای گرده افشان‌ها بی‌ضرر در نظر گرفته می‌شوند، بنابراین در طول دوره گلدهی به باغبانان توصیه می‌شوند. قرار گرفتن در معرض و مصرف این قارچ‌کش‌ها توسط زنبورها نسبتاً شناخته شده است، زیرا بخشی از فرآیند ثبت آفت‌کش‌ها توسط آژانس حفاظت از محیط زیست ایالات متحده و بسیاری از آژانس‌های نظارتی ملی دیگر است12،13،14. با این حال، اثرات قارچ‌کش‌ها بر روی غیر زنبورها کمتر شناخته شده است زیرا طبق توافق‌نامه‌های مجوز بازاریابی در ایالات متحده الزامی نیستند15. علاوه بر این، به طور کلی هیچ پروتکل استانداردی برای آزمایش زنبورهای منفرد16،17 وجود ندارد و نگهداری از کلنی‌هایی که زنبورها را برای آزمایش فراهم می‌کنند چالش برانگیز است18. آزمایش‌های مختلف زنبورهای مدیریت شده به طور فزاینده‌ای در اروپا و ایالات متحده برای مطالعه اثرات آفت‌کش‌ها بر زنبورهای وحشی انجام می‌شود و اخیراً پروتکل‌های استانداردی برای O. cornifrons19 تدوین شده است.
زنبورهای شاخدار مونوسیت هستند و به صورت تجاری در مزارع پرورش کپور به عنوان مکمل یا جایگزین زنبورهای عسل استفاده می‌شوند. این زنبورها بین ماه‌های مارس و آوریل ظاهر می‌شوند و نرهای زودرس سه تا چهار روز قبل از ماده‌ها ظاهر می‌شوند. پس از جفت‌گیری، زنبور ماده به طور فعال گرده و شهد را جمع‌آوری می‌کند تا مجموعه‌ای از سلول‌های نوزاد را در حفره لانه لوله‌ای (طبیعی یا مصنوعی)1،20 فراهم کند. تخم‌ها روی گرده درون سلول‌ها گذاشته می‌شوند. سپس زنبور ماده قبل از آماده‌سازی سلول بعدی، یک دیوار رسی می‌سازد. لاروهای سن اول در کوریون محصور شده و از مایعات جنینی تغذیه می‌کنند. از سن دوم تا پنجم (پیش‌شفیره)، لاروها از گرده تغذیه می‌کنند22. هنگامی که ذخیره گرده به طور کامل تمام شد، لاروها پیله تشکیل می‌دهند، شفیره می‌شوند و معمولاً در اواخر تابستان20،23 به عنوان بالغ در همان محفظه نوزاد ظاهر می‌شوند. بالغ‌ها بهار بعد ظاهر می‌شوند. بقای بالغ‌ها با افزایش انرژی خالص (افزایش وزن) بر اساس مصرف غذا مرتبط است. بنابراین، کیفیت تغذیه‌ای گرده، و همچنین عوامل دیگری مانند آب و هوا یا قرار گرفتن در معرض آفت‌کش‌ها، از عوامل تعیین‌کننده بقا و سلامت هستند.
حشره‌کش‌ها و قارچ‌کش‌هایی که قبل از گلدهی استفاده می‌شوند، قادرند در درجات مختلفی از نفوذ در رگ‌های گیاه، از انتقال از سطح بالایی برگ‌ها به سطح پایینی، مانند برخی از قارچ‌کش‌ها، 25 تا اثرات واقعاً سیستمیک، در داخل عروق گیاه حرکت کنند. که می‌توانند از ریشه به تاج نفوذ کنند، می‌توانند وارد شهد گل‌های سیب شوند26، جایی که می‌توانند حشرات بالغ O. cornifrons27 را از بین ببرند. برخی از آفت‌کش‌ها همچنین به گرده‌ها نفوذ می‌کنند و بر رشد لاروهای ذرت تأثیر می‌گذارند و باعث مرگ آنها می‌شوند19. مطالعات دیگر نشان داده‌اند که برخی از قارچ‌کش‌ها می‌توانند رفتار لانه‌سازی گونه‌های مرتبط O. lignaria28 را به طور قابل توجهی تغییر دهند. علاوه بر این، مطالعات آزمایشگاهی و میدانی که سناریوهای قرار گرفتن در معرض آفت‌کش‌ها (از جمله قارچ‌کش‌ها) را شبیه‌سازی می‌کنند، نشان داده‌اند که آفت‌کش‌ها بر فیزیولوژی 22 مورفولوژی 29 و بقای زنبورهای عسل و برخی از زنبورهای انفرادی تأثیر منفی می‌گذارند. اسپری‌های مختلف قارچ‌کش که مستقیماً در طول گلدهی روی گل‌های باز اعمال می‌شوند، ممکن است گرده‌های جمع‌آوری شده توسط حشرات بالغ برای رشد لارو را آلوده کنند که اثرات آن هنوز مورد مطالعه قرار نگرفته است30.
به طور فزاینده‌ای مشخص شده است که رشد لارو تحت تأثیر گرده و جوامع میکروبی دستگاه گوارش قرار دارد. میکروبیوم زنبور عسل بر پارامترهایی مانند جرم بدن31، تغییرات متابولیک22 و حساسیت به عوامل بیماری‌زا32 تأثیر می‌گذارد. مطالعات قبلی تأثیر مرحله رشد، مواد مغذی و محیط را بر میکروبیوم زنبورهای انفرادی بررسی کرده‌اند. این مطالعات شباهت‌هایی را در ساختار و فراوانی میکروبیوم‌های لارو و گرده33، و همچنین رایج‌ترین جنس‌های باکتریایی سودوموناس و دلفتیا، در بین گونه‌های زنبور انفرادی نشان داده‌اند. با این حال، اگرچه قارچ‌کش‌ها با استراتژی‌هایی برای محافظت از سلامت زنبورها مرتبط بوده‌اند، اما اثرات قارچ‌کش‌ها بر میکروبیوتای لارو از طریق مواجهه مستقیم دهانی هنوز ناشناخته مانده است.
این مطالعه اثرات دوزهای واقعی شش قارچ‌کش رایج ثبت‌شده برای استفاده روی میوه‌های درختی در ایالات متحده، از جمله قارچ‌کش‌های تماسی و سیستمیک که به صورت خوراکی به لاروهای پروانه کرم شاخ‌دار ذرت از غذای آلوده تجویز می‌شوند، را آزمایش کرد. ما دریافتیم که قارچ‌کش‌های تماسی و سیستمیک باعث کاهش افزایش وزن بدن زنبورها و افزایش مرگ و میر می‌شوند، و شدیدترین اثرات مربوط به مانکوزب و پیریتیوپید است. سپس تنوع میکروبی لاروهای تغذیه‌شده با رژیم غذایی گرده تیمار شده با مانکوزب را با لاروهای تغذیه‌شده با رژیم غذایی کنترل مقایسه کردیم. ما در مورد مکانیسم‌های بالقوه مرگ و میر و پیامدهای آن برای برنامه‌های مدیریت تلفیقی آفات و گرده‌افشان‌ها (IPPM)36 بحث می‌کنیم.
حشرات بالغ O. cornifrons که در پیله‌ها زمستان‌گذرانی می‌کردند، از مرکز تحقیقات میوه، بیگلرویل، پنسیلوانیا، تهیه و در دمای 3- تا 2 درجه سانتیگراد (±0.3 درجه سانتیگراد) نگهداری شدند. قبل از آزمایش (در مجموع 600 پیله). در ماه مه 2022، روزانه 100 پیله O. cornifrons به فنجان‌های پلاستیکی (50 پیله در هر فنجان، DI 5 سانتی‌متر × 15 سانتی‌متر طول) منتقل شدند و دستمال‌های مرطوب داخل فنجان‌ها قرار داده شدند تا باز شدن پیله‌ها را تسریع کرده و یک بستر جویدنی فراهم کنند و استرس روی زنبورهای سنگی را کاهش دهند37. دو فنجان پلاستیکی حاوی پیله‌ها را در یک قفس حشرات (30 × 30 × 30 سانتی‌متر، BugDorm MegaView Science Co. Ltd.، تایوان) با 10 میلی‌لیتر غذادهنده حاوی 50٪ محلول ساکارز قرار دهید و به مدت چهار روز نگهداری کنید تا از بسته شدن و جفت‌گیری اطمینان حاصل شود. 23 درجه سانتیگراد، رطوبت نسبی 60٪، دوره نوری 10 لیتر (شدت کم): 14 روز. ۱۰۰ ماده و نر جفت‌گیری‌شده هر روز صبح به مدت شش روز (۱۰۰ عدد در روز) در طول اوج گلدهی سیب در دو لانه مصنوعی رها شدند (لانه تله‌ای: عرض ۳۳.۶۶ × ارتفاع ۳۰.۴۸ × طول ۴۶.۹۹ سانتی‌متر؛ شکل تکمیلی ۱). این خانه پرنده در باغ گیاه‌شناسی ایالت پنسیلوانیا، نزدیک گیلاس (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™)، هلو (Prunus persica 'Contender')، Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®)، گلابی (Pyrus perifolia 'Olympic'، Pyrus perifolia 'Shink'، Pyrus perfolia 'Shinseiki')، درخت سیب کروناریا (Malus coronaria) و انواع متعددی از درختان سیب (Malus coronaria، Malus)، درخت سیب اهلی 'Co-op 30′ Enterprise™، درخت سیب Malus 'Co-Op 31′ Winecrisp™، بگونیا 'Freedom'، بگونیا 'Golden Delicious'، بگونیا 'Nova Spy' قرار گرفته است. هر لانه پرنده پلاستیکی آبی رنگ روی دو جعبه چوبی قرار می‌گیرد. هر جعبه لانه حاوی ۸۰۰ لوله کاغذی کرافت خالی (مارپیچی باز، قطر داخلی ۰.۸ سانتی‌متر × طول ۱۵ سانتی‌متر) (شرکت لوله کاغذی جونزویل، میشیگان) بود که در لوله‌های سلفون مات (۰.۷ قطر خارجی) قرار داده شده بودند. درپوش‌های پلاستیکی (درپوش‌های T-1X) محل لانه‌سازی را فراهم می‌کنند.
هر دو لانه رو به شرق بودند و با حصار باغی پلاستیکی سبز (مدل Everbilt شماره 889250EB12، اندازه دهانه 5 × 5 سانتی‌متر، 0.95 متر × 100 متر) پوشانده شده بودند تا از دسترسی جوندگان و پرندگان جلوگیری شود و روی سطح خاک در کنار لانه‌های لانه قرار داده شدند. لانه (شکل تکمیلی 1a). تخم‌های کرم ساقه‌خوار ذرت روزانه با جمع‌آوری 30 لوله از لانه‌ها و انتقال آنها به آزمایشگاه جمع‌آوری می‌شدند. با استفاده از قیچی، برشی در انتهای لوله ایجاد کنید، سپس لوله مارپیچی را جدا کنید تا سلول‌های لارو نمایان شوند. تخم‌ها و گرده‌های آنها با استفاده از یک کاردک خمیده (کیت ابزار Microslide، BioQuip Products Inc.، کالیفرنیا) برداشته شدند. تخم‌ها قبل از استفاده در آزمایش‌های ما، روی کاغذ صافی مرطوب انکوبه شده و به مدت 2 ساعت در ظرف پتری قرار داده شدند (شکل تکمیلی 1b-d).
در آزمایشگاه، سمیت خوراکی شش قارچ‌کش مورد استفاده قبل و در طول شکوفه‌دهی سیب را در سه غلظت (0.1X، 0.5X و 1X، که در آن 1X علامت مورد استفاده در هر 100 گالن آب در هکتار است. دوز بالای مزرعه = غلظت در مزرعه). جدول 1. هر غلظت 16 بار تکرار شد (n = 16). دو قارچ‌کش تماسی (جدول S1: مانکوزب 2696.14 ppm و کاپتان 2875.88 ppm) و چهار قارچ‌کش سیستمیک (جدول S1: پیریتیوستروبین 250.14 ppm؛ تریفلوکسی‌استروبین 110.06 ppm؛ میکلوبوتانیل آزول 75.12 ppm؛ سیپرودینیل 280.845 ppm) برای میوه‌ها، سبزیجات و محصولات زینتی ارزیابی کردیم. ما گرده را با استفاده از آسیاب همگن کردیم، 0.20 گرم را به یک چاهک (پلیت فالکون 24 چاهکی) منتقل کردیم و 1 میکرولیتر محلول قارچ‌کش را اضافه و مخلوط کردیم تا گرده هرمی با چاهک‌های عمیق 1 میلی‌متری تشکیل شود که تخم‌ها در آنها قرار داده شدند. با استفاده از یک اسپاتول کوچک (شکل تکمیلی 1c، d) قرار دهید. صفحات فالکون در دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد) و رطوبت نسبی 70٪ نگهداری شدند. ما آنها را با لاروهای کنترل که با رژیم غذایی گرده همگن و با آب خالص تغذیه شده بودند، مقایسه کردیم. ما مرگ و میر را ثبت کردیم و وزن لارو را هر روز دیگر تا زمانی که لاروها به سن پیش شفیرگی رسیدند با استفاده از یک ترازوی تحلیلی (Fisher Scientific، دقت = 0.0001 گرم) اندازه‌گیری کردیم. در نهایت، نسبت جنسی با باز کردن پیله پس از 2.5 ماه ارزیابی شد.
DNA از لارو کامل O. cornifrons (n ​​= 3 در هر شرایط تیمار، گرده تیمار شده با مانکوزب و گرده تیمار نشده) استخراج شد و ما تجزیه و تحلیل تنوع میکروبی را روی این نمونه‌ها انجام دادیم، به خصوص به این دلیل که در مانکوزب بیشترین مرگ و میر در لاروهایی که MnZn دریافت می‌کردند، مشاهده شد. DNA با استفاده از کیت DNA DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead (Zymo Research، ایروین، کالیفرنیا) تکثیر و خالص‌سازی شد و با استفاده از کیت v3 روی Illumina® MiSeq™ توالی‌یابی (600 چرخه) شد. توالی‌یابی هدفمند ژن‌های RNA ریبوزومی 16S باکتریایی با استفاده از کیت Quick-16S™ NGS Library Prep (Zymo Research، ایروین، کالیفرنیا) با استفاده از آغازگرهایی که ناحیه V3-V4 ژن rRNA 16S را هدف قرار می‌دهند، انجام شد. علاوه بر این، توالی‌یابی 18S با استفاده از 10٪ گنجاندن PhiX انجام شد و تکثیر با استفاده از جفت آغازگر 18S001 و NS4 انجام شد.
با استفاده از خط لوله QIIME2 (نسخه 2022.11.1)، داده‌های جفت‌شده39 را وارد و پردازش کنید. این داده‌ها برش داده شده و ادغام شدند و توالی‌های کایمریک با استفاده از افزونه DADA2 در QIIME2 (جفت‌سازی نویز qiime dada2)40 حذف شدند. تخصیص کلاس‌های 16S و 18S با استفاده از افزونه طبقه‌بندی‌کننده شیء Classify-sklearn و مصنوع از پیش آموزش‌دیده silva-138-99-nb-classifier انجام شد.
تمام داده‌های تجربی از نظر نرمال بودن (شاپیرو-ویلکس) و همگنی واریانس‌ها (آزمون لون) بررسی شدند. از آنجا که مجموعه داده‌ها فرضیات تحلیل پارامتری را برآورده نمی‌کرد و تبدیل نتوانست باقیمانده‌ها را استاندارد کند، ما یک آنالیز واریانس دوطرفه غیرپارامتری (کروسکال-والیس) با دو عامل [زمان (سه مرحله‌ای 2، 5 و 8 روزه) و قارچ‌کش] انجام دادیم تا تأثیر تیمار بر وزن تازه لارو را ارزیابی کنیم، سپس مقایسه‌های جفتی غیرپارامتری پس از وقوع با استفاده از آزمون ویلکاکسون انجام شد. ما از یک مدل خطی تعمیم‌یافته (GLM) با توزیع پواسون برای مقایسه اثرات قارچ‌کش‌ها بر بقا در سه غلظت قارچ‌کش استفاده کردیم41،42. برای تحلیل فراوانی افتراقی، تعداد گونه‌های توالی آمپلیکون (ASV) در سطح جنس کاهش یافت. مقایسه فراوانی افتراقی بین گروه‌ها با استفاده از فراوانی نسبی 16S (سطح جنس) و 18S با استفاده از یک مدل جمعی تعمیم‌یافته برای موقعیت، مقیاس و شکل (GAMLSS) با توزیع‌های خانواده بتا صفر متورم (BEZI) انجام شد که بر روی یک ماکرو مدل‌سازی شده بودند. در Microbiome R43 (نسخه 1.1). 1. گونه‌های میتوکندریایی و کلروپلاست را قبل از تجزیه و تحلیل افتراقی حذف کنید. به دلیل سطوح مختلف طبقه‌بندی 18S، فقط پایین‌ترین سطح هر طبقه‌بندی برای تجزیه و تحلیل‌های افتراقی استفاده شد. تمام تجزیه و تحلیل‌های آماری با استفاده از R (نسخه 3.4.3.، پروژه CRAN) (Team 2013) انجام شد.
قرار گرفتن در معرض مانکوزب، پیریتیوستروبین و تریفلوکسی استروبین به طور قابل توجهی افزایش وزن بدن را در O. cornifrons کاهش داد (شکل 1). این اثرات به طور مداوم برای هر سه دوز ارزیابی شده مشاهده شد (شکل 1a-c). سیکلوستروبین و میکلوبوتانیل وزن لاروها را به طور قابل توجهی کاهش ندادند.
میانگین وزن تازه لاروهای ساقه‌خوار در سه نقطه زمانی تحت چهار تیمار غذایی (خوراک همگن گرده + قارچ‌کش: شاهد، دوزهای 0.1X، 0.5X و 1X) اندازه‌گیری شد. (الف) دوز پایین (0.1X): نقطه زمانی اول (روز 1): χ2: 30.99، DF = 6؛ P < 0.0001، نقطه زمانی دوم (روز 5): 22.83، DF = 0.0009؛ بار سوم؛ نقطه زمانی (روز 8): χ2: 28.39، DF = 6؛ (ب) نصف دوز (0.5X): نقطه زمانی اول (روز 1): χ2: 35.67، DF = 6؛ P < 0.0001، نقطه زمانی دوم (روز اول): χ2: 15.98، DF = 6؛ P = 0.0090؛ نقطه زمانی سوم (روز 8) χ2: 16.47، DF = 6؛ (ج) محل یا دوز کامل (1X): نقطه زمانی اول (روز 1) χ2: 20.64، P = 6؛ P = 0.0326، نقطه زمانی دوم (روز 5): χ2: 22.83، DF = 6؛ P = 0.0009؛ نقطه زمانی سوم (روز 8): χ2: 28.39، DF = 6؛ آنالیز واریانس غیرپارامتری. میله‌ها نشان دهنده میانگین ± خطای استاندارد مقایسه‌های زوجی (α = 0.05) (n = 16) *P ≤ 0.05، **P ≤ 0.001، ***P ≤ 0.0001 هستند.
در کمترین دوز (0.1X)، وزن بدن لارو با تریفلوکسی استروبین 60٪، با مانکوزب 49٪، با میکلوبوتانیل 48٪ و با پیریتیستروبین 46٪ کاهش یافت (شکل 1a). هنگامی که لاروها در معرض نصف دوز میدانی (0.5X) قرار گرفتند، وزن بدن لاروهای مانکوزب 86٪، پیریتیاستروبین 52٪ و تریفلوکسی استروبین 50٪ کاهش یافت (شکل 1b). دوز کامل میدانی (1X) مانکوزب، وزن لارو را 82٪، پیریتیاستروبین 70٪ و تریفلوکسی استروبین، میکلوبوتانیل و سنگارد را تقریباً 30٪ کاهش داد (شکل 1c).
مرگ و میر در بین لاروهایی که با گرده تیمار شده با مانکوزب تغذیه شده بودند، بیشترین میزان را داشت و پس از آن پیریتیوستروبین و تریفلوکسی استروبین قرار داشتند. مرگ و میر با افزایش دوزهای مانکوزب و پیریتیسولین افزایش یافت (شکل 2؛ جدول 2). با این حال، مرگ و میر کرم ساقه خوار ذرت با افزایش غلظت تریفلوکسی استروبین تنها اندکی افزایش یافت؛ سیپرودینیل و کاپتان در مقایسه با تیمارهای شاهد، مرگ و میر را به طور قابل توجهی افزایش ندادند.
مرگ و میر لاروهای مگس چوبخوار پس از مصرف گرده‌هایی که به صورت جداگانه با شش قارچ‌کش مختلف تیمار شده بودند، مقایسه شد. مانکوزب و پنتوپیرامید نسبت به مواجهه خوراکی با لارو ذرت حساس‌تر بودند (GLM: χ = 29.45، DF = 20، P = 0.0059) (خط، شیب = 0.29، P < 0.001؛ شیب = 0.24، P < 0.00)).
به طور متوسط، در تمام درمان‌ها، 39.05٪ از بیماران زن و 60.95٪ مرد بودند. در بین درمان‌های کنترل، نسبت زنان در هر دو مطالعه با دوز پایین (0.1X) و نیم دوز (0.5X) 40٪ و در مطالعات با دوز میدانی (1X) 30٪ بود. در دوز 0.1X، در بین لاروهای تغذیه شده با گرده که با مانکوزب و میکلوبوتانیل درمان شدند، 33.33٪ از بزرگسالان ماده، 22٪ از بزرگسالان ماده، 44٪ از لاروهای بالغ ماده، 44٪ از لاروهای بالغ ماده، 41٪ از لاروهای بالغ ماده و 31٪ از گروه کنترل بودند (شکل 3a). در دوز 0.5 برابر، 33٪ از کرم‌های بالغ در گروه مانکوزب و پیریتیوستروبین ماده، 36٪ در گروه تریفلوکسی‌استروبین، 41٪ در گروه میکلوبوتانیل و 46٪ در گروه سیپروستروبین بودند. این رقم در گروه کاپتان 53٪ و در گروه کنترل 38٪ بود (شکل 3b). در دوز 1X، 30٪ از گروه مانکوزب زن، 36٪ از گروه پیریتیوستروبین، 44٪ از گروه تریفلوکسی‌استروبین، 38٪ از گروه میکلوبوتانیل، 50٪ از گروه کنترل زن بودند - 38.5٪ (شکل 3c).
درصد حشرات ماده و نر پس از مواجهه با قارچ‌کش در مرحله لاروی. (الف) دوز پایین (0.1X). ​​(ب) نصف دوز (0.5X). (ج) دوز میدانی یا دوز کامل (1X).
تجزیه و تحلیل توالی 16S نشان داد که گروه باکتریایی بین لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار شده با مانکوزب و لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار نشده متفاوت است (شکل 4a). شاخص میکروبی لاروهای تیمار نشده تغذیه شده با گرده بیشتر از لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار شده با مانکوزب بود (شکل 4b). اگرچه تفاوت مشاهده شده در غنای بین گروه‌ها از نظر آماری معنی‌دار نبود، اما به طور قابل توجهی کمتر از لاروهای تغذیه شده با گرده تیمار نشده بود (شکل 4c). فراوانی نسبی نشان داد که میکروبیوتای لاروهای تغذیه شده با گرده کنترل متنوع‌تر از لاروهای تغذیه شده با لاروهای تیمار شده با مانکوزب بود (شکل 5a). تجزیه و تحلیل توصیفی وجود 28 جنس را در نمونه‌های کنترل و تیمار شده با مانکوزب نشان داد (شکل 5b). تجزیه و تحلیل c با استفاده از توالی‌یابی 18S هیچ تفاوت معنی‌داری را نشان نداد (شکل تکمیلی 2).
پروفایل‌های SAV بر اساس توالی‌های 16S با غنای شانون و غنای مشاهده‌شده در سطح شاخه مقایسه شدند. (الف) تجزیه و تحلیل مختصات اصلی (PCoA) بر اساس ساختار کلی جامعه میکروبی در لاروهای تغذیه‌شده با گرده یا کنترل نشده (آبی) و تغذیه‌شده با مانکوزب (نارنجی). هر نقطه داده نشان دهنده یک نمونه جداگانه است. PCoA با استفاده از فاصله Bray-Curtis از توزیع t چند متغیره محاسبه شد. بیضی‌ها نشان دهنده سطح اطمینان 80٪ هستند. (ب) نمودار جعبه‌ای، داده‌های خام ثروت شانون (نقاط) و ج. ثروت قابل مشاهده. نمودارهای جعبه‌ای کادرهایی را برای خط میانه، دامنه بین چارکی (IQR) و 1.5 × IQR (n = 3) نشان می‌دهند.
ترکیب جوامع میکروبی لاروهای تغذیه شده با گرده‌های تیمار شده با مانکوزب و تیمار نشده. (الف) فراوانی نسبی گونه‌های میکروبی در لاروها. (ب) نقشه حرارتی جوامع میکروبی شناسایی شده. دلفتیا (نسبت شانس (OR) = 0.67، P = 0.0030) و سودوموناس (OR = 0.3، P = 0.0074)، میکروباکتریوم (OR = 0.75، P = 0.0617) (OR = 1.5، P = 0.0060)؛ ردیف‌های نقشه حرارتی با استفاده از فاصله همبستگی و میانگین اتصال خوشه‌بندی می‌شوند.
نتایج ما نشان می‌دهد که قرار گرفتن در معرض قارچ‌کش‌های تماسی (مانکوزب) و سیستمیک (پیروستروبین و تریفلوکسی‌استروبین) که به طور گسترده در طول گلدهی استفاده می‌شوند، به طور قابل توجهی افزایش وزن و افزایش مرگ و میر لاروهای ذرت را کاهش می‌دهد. علاوه بر این، مانکوزب به طور قابل توجهی تنوع و غنای میکروبیوم را در مرحله پیش شفیرگی کاهش داد. میکلوبوتانیل، یکی دیگر از قارچ‌کش‌های سیستمیک، افزایش وزن بدن لاروها را در هر سه دوز به طور قابل توجهی کاهش داد. این اثر در نقاط زمانی دوم (روز 5) و سوم (روز 8) مشهود بود. در مقابل، سیپرودینیل و کاپتان در مقایسه با گروه کنترل، افزایش وزن یا بقا را به طور قابل توجهی کاهش ندادند. تا آنجا که ما می‌دانیم، این اولین مطالعه‌ای است که اثرات میزان مزرعه‌ای قارچ‌کش‌های مختلف مورد استفاده برای محافظت از محصولات ذرت از طریق قرار گرفتن مستقیم در معرض گرده را تعیین می‌کند.
همه تیمارهای قارچ‌کشی در مقایسه با تیمارهای کنترل، افزایش وزن بدن را به طور قابل توجهی کاهش دادند. مانکوزب با میانگین کاهش 51٪، بیشترین تأثیر را بر افزایش وزن بدن لاروها داشت و پس از آن پیریتیوستروبین قرار گرفت. با این حال، مطالعات دیگر اثرات نامطلوب دوزهای میدانی قارچ‌کش‌ها را بر مراحل لاروی گزارش نکرده‌اند44. اگرچه نشان داده شده است که زیست‌کش‌های دی‌تیوکاربامات سمیت حاد کمی دارند45، اتیلن بیس‌دی‌تیوکاربامات‌ها (EBDCS) مانند مانکوزب می‌توانند به اوره اتیلن سولفید تجزیه شوند. با توجه به اثرات جهش‌زای آن در سایر حیوانات، این محصول تجزیه ممکن است مسئول اثرات مشاهده شده باشد46،47. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که تشکیل اتیلن تیواوره تحت تأثیر عواملی مانند دمای بالا48، سطح رطوبت49 و مدت زمان نگهداری محصول50 قرار دارد. شرایط مناسب نگهداری زیست‌کش‌ها می‌تواند این عوارض جانبی را کاهش دهد. علاوه بر این، سازمان ایمنی مواد غذایی اروپا نگرانی خود را در مورد سمیت پیریتیوپید ابراز کرده است که نشان داده شده است برای سیستم گوارش سایر حیوانات سرطان‌زا است51.
تجویز خوراکی مانکوزب، پیریتیوستروبین و تریفلوکسی استروبین باعث افزایش مرگ و میر لاروهای کرم ساقه‌خوار ذرت می‌شود. در مقابل، میکلوبوتانیل، سیپروسایکلین و کاپتان هیچ تاثیری بر مرگ و میر نداشتند. این نتایج با نتایج لادورنر و همکاران52 متفاوت است، که نشان دادند کاپتان به طور قابل توجهی بقای حشرات بالغ O. lignaria و Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apisidae) را کاهش می‌دهد. علاوه بر این، مشخص شده است که قارچ‌کش‌هایی مانند کاپتان و بوسکالید باعث مرگ و میر لاروها52،53،54 یا تغییر رفتار تغذیه‌ای55 می‌شوند. این تغییرات به نوبه خود می‌توانند بر کیفیت تغذیه‌ای گرده و در نهایت افزایش انرژی مرحله لاروی تأثیر بگذارند. مرگ و میر مشاهده شده در گروه کنترل با سایر مطالعات 56،57 مطابقت داشت.
نسبت جنسیتی مطلوب‌تر برای نرها که در کار ما مشاهده شد، ممکن است با عواملی مانند جفت‌گیری ناکافی و شرایط نامساعد آب و هوایی در طول گلدهی توضیح داده شود، همانطور که قبلاً توسط ویسنس و بوش برای O. cornuta پیشنهاد شده بود. اگرچه ماده‌ها و نرها در مطالعه ما چهار روز برای جفت‌گیری فرصت داشتند (دوره‌ای که عموماً برای جفت‌گیری موفق کافی در نظر گرفته می‌شود)، ما عمداً شدت نور را کاهش دادیم تا استرس را به حداقل برسانیم. با این حال، این تغییر ممکن است ناخواسته در فرآیند جفت‌گیری اختلال ایجاد کند61. علاوه بر این، زنبورها چندین روز آب و هوای نامساعد، از جمله باران و دمای پایین (کمتر از 5 درجه سانتیگراد) را تجربه می‌کنند که می‌تواند بر موفقیت جفت‌گیری نیز تأثیر منفی بگذارد4،23.
اگرچه مطالعه ما بر کل میکروبیوم لارو متمرکز بود، نتایج ما بینشی در مورد روابط بالقوه بین جوامع باکتریایی ارائه می‌دهد که ممکن است برای تغذیه زنبورها و قرار گرفتن در معرض قارچ‌کش‌ها حیاتی باشد. به عنوان مثال، لاروهایی که از گرده تیمار شده با مانکوزب تغذیه شده بودند، در مقایسه با لاروهایی که از گرده تیمار نشده تغذیه شده بودند، ساختار و فراوانی جامعه میکروبی را به طور قابل توجهی کاهش داده بودند. در لاروهایی که از گرده تیمار نشده تغذیه می‌کردند، گروه‌های باکتریایی پروتئوباکتریا و اکتینوباکتریا غالب بودند و عمدتاً هوازی یا هوازی اختیاری بودند. باکتری‌های دلفت، که معمولاً با گونه‌های زنبورهای انفرادی مرتبط هستند، به داشتن فعالیت آنتی‌بیوتیکی معروف هستند که نشان دهنده نقش محافظتی بالقوه در برابر عوامل بیماری‌زا است. گونه باکتریایی دیگری به نام سودوموناس، در لاروهایی که از گرده تیمار نشده تغذیه شده بودند، فراوان بود، اما در لاروهای تیمار شده با مانکوزب به طور قابل توجهی کاهش یافت. نتایج ما از مطالعات قبلی که سودوموناس را به عنوان یکی از فراوان‌ترین جنس‌ها در O. bicornis35 و سایر زنبورهای انفرادی34 شناسایی می‌کردند، پشتیبانی می‌کند. اگرچه شواهد تجربی برای نقش سودوموناس در سلامت O. cornifrons مورد مطالعه قرار نگرفته است، اما نشان داده شده است که این باکتری سنتز سموم محافظ را در سوسک Paederus fuscipes افزایش می‌دهد و متابولیسم آرژنین را در شرایط آزمایشگاهی 35، 65 تقویت می‌کند. این مشاهدات نقش بالقوه‌ای را در دفاع ویروسی و باکتریایی در طول دوره رشد لارو O. cornifrons نشان می‌دهد. Microbacterium جنس دیگری است که در مطالعه ما شناسایی شده است و گزارش شده است که به تعداد زیاد در لارو مگس سرباز سیاه در شرایط گرسنگی وجود دارد66. در لارو O. cornifrons، Microbacteria ممکن است در تعادل و انعطاف‌پذیری میکروبیوم روده در شرایط استرس نقش داشته باشد. علاوه بر این، Rhodococcus در لارو O. cornifrons یافت می‌شود و به دلیل توانایی‌های سم‌زدایی خود شناخته شده است67. این جنس همچنین در روده A. florea یافت می‌شود، اما در فراوانی بسیار کم 68. نتایج ما وجود تغییرات ژنتیکی متعدد در گونه‌های میکروبی متعدد را نشان می‌دهد که می‌توانند فرآیندهای متابولیکی را در لاروها تغییر دهند. با این حال، درک بهتری از تنوع عملکردی O. cornifrons مورد نیاز است.
به طور خلاصه، نتایج نشان می‌دهد که مانکوزب، پیریتیوستروبین و تریفلوکسی‌استروبین باعث کاهش افزایش وزن بدن و افزایش مرگ و میر لاروهای کرم ساقه‌خوار ذرت می‌شوند. اگرچه نگرانی فزاینده‌ای در مورد اثرات قارچ‌کش‌ها بر گرده‌افشان‌ها وجود دارد، اما نیاز به درک بهتر اثرات متابولیت‌های باقیمانده این ترکیبات وجود دارد. این نتایج را می‌توان در توصیه‌هایی برای برنامه‌های مدیریت یکپارچه گرده‌افشان گنجاند که به کشاورزان کمک می‌کند تا با انتخاب قارچ‌کش‌ها و تغییر زمان استفاده، یا با تشویق به استفاده از جایگزین‌های کم‌خطرتر، از استفاده از برخی قارچ‌کش‌ها قبل و در طول گلدهی درختان میوه اجتناب کنند. ۳۶. این اطلاعات برای تدوین توصیه‌هایی در مورد استفاده از آفت‌کش‌ها، مانند تنظیم برنامه‌های سم‌پاشی موجود و تغییر زمان سم‌پاشی هنگام انتخاب قارچ‌کش‌ها یا ترویج استفاده از جایگزین‌های کم‌خطرتر، مهم است. تحقیقات بیشتری در مورد اثرات نامطلوب قارچ‌کش‌ها بر نسبت جنسی، رفتار تغذیه‌ای، میکروبیوم روده و مکانیسم‌های مولکولی زمینه‌ساز کاهش وزن و مرگ و میر کرم ساقه‌خوار ذرت مورد نیاز است.
داده‌های منبع ۱، ۲ و ۳ در شکل‌های ۱ و ۲ در مخزن داده‌های figshare با شناسه‌های DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 و https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233 ذخیره شده‌اند. توالی‌های مورد تجزیه و تحلیل در مطالعه حاضر (شکل‌های ۴ و ۵) در مخزن NCBI SRA با شماره دسترسی PRJNA1023565 موجود است.
بوش، جی. و کمپ، دبلیو پی. توسعه و استقرار گونه‌های زنبور عسل به عنوان گرده افشان محصولات کشاورزی: ​​مثالی از جنس Osmia. (Hymenoptera: Megachilidae) و درختان میوه. bull. Ntomore. resource. 92, 3–16 (2002).
پارکر، ام جی و همکاران. شیوه‌های گرده افشانی و برداشت‌ها از گرده افشان‌های جایگزین در میان پرورش دهندگان سیب در نیویورک و پنسیلوانیا. به‌روزرسانی. کشاورزی. سیستم‌های غذایی. 35، 1-14 (2020).
کخ آی.، لونسدورف ای. دبلیو.، آرتز دی. آر.، پیتس-سینگر تی. ال. و ریکتس تی. اچ. بوم‌شناسی و اقتصاد گرده‌افشانی بادام با استفاده از زنبورهای بومی. مجله اقتصاد. انتومور. 111، 16–25 (2018).
لی، ای.، هی، وای.، و پارک، وای.-ال. اثرات تغییرات اقلیمی بر فنولوژی کتیرا: پیامدهایی برای مدیریت جمعیت. Climb. Change 150، 305–317 (2018).
آرتز، دی‌آر و پیتس-سینگر، تی‌ال. تأثیر اسپری‌های قارچ‌کش و مواد کمکی بر رفتار لانه‌سازی دو زنبور عسل انفرادی تحت مدیریت (Osmia lignaria و Megachile rotundata). PloS One 10، e0135688 (2015).
بووه، س. و همکاران. یک قارچ‌کش کم‌سمی برای محصولات زراعی (فنبوکونازول) با سیگنال‌های کیفیت تولید مثلی نر تداخل می‌کند و منجر به کاهش موفقیت جفت‌گیری در زنبورهای وحشی منزوی می‌شود. مجله علوم کاربردی. بوم‌شناسی. 59، 1596–1607 (2022).
اسگولاسترا اف. و همکاران. حشره‌کش‌های نئونیکوتینوئید و بیوسنتز ارگوسترول، مرگ و میر ناشی از قارچ‌کش‌ها را در سه گونه زنبور عسل سرکوب می‌کنند. کنترل آفات. علم. 73، 1236–1243 (2017).
کوهنمن جی‌جی، گیلونگ جی، ون دایک ام‌تی، فوردایس آر‌اف. و دنفورث بی‌ان. لاروهای زنبورهای انفرادی، تنوع باکتریایی تأمین‌شده توسط گرده برای زنبورهای لانه‌ساز ساقه را تغییر می‌دهند. Osmia cornifrons (Megachilidae). front. microorganism. 13, 1057626 (2023).
دارامپال پی‌اس، دنفورث بی ان و استفان اس ای. میکروارگانیسم‌های برون‌همزیست موجود در گرده تخمیر شده به اندازه خود گرده برای رشد زنبورهای انفرادی مهم هستند. بوم‌شناسی. تکامل. 12. e8788 (2022).
کلدرر ام، مانیسی ال‌ام، کاپوتو اف و تالهایمر ام. کاشت بین ردیفی در باغ‌های سیب برای کنترل بیماری‌های ناشی از جوانه‌زنی مجدد: یک مطالعه اثربخشی عملی بر اساس شاخص‌های میکروبی. Plant Soil 357، 381-393 (2012).
مارتین پی‌ال، کراوچیک تی.، خدادادی اف.، آخیموویچ اس‌جی و پیتر کی‌ای. پوسیدگی تلخ سیب در ایالات متحده در میانه اقیانوس اطلس: ارزیابی گونه‌های عامل بیماری و تأثیر شرایط آب و هوایی منطقه‌ای و حساسیت رقم. فیتوپاتولوژی 111، 966–981 (2021).
کالن ام جی، تامپسون ال جی، کارولان جی کی، استاوت جی کی و استنلی دی ای. قارچ کش ها، علف کش ها و زنبورها: مروری سیستماتیک بر تحقیقات و روش های موجود. PLoS One 14, e0225743 (2019).
پیلینگ، ای. دی. و جپسون، پی. سی. اثرات هم‌افزایی قارچ‌کش‌های EBI و حشره‌کش‌های پایرتروئیدی بر زنبورهای عسل (Apis mellifera). آفات علم. 39، 293–297 (1993).
ماسن، ای سی، لوپز، جی ای و پنگ، سی وای. تأثیر قارچ‌کش‌های منتخب بر رشد و نمو لارو زنبور عسل Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae). چهارشنبه. انتومور. 33، 1151-1154 (2004).
ون دایک، م.، مولن، ای.، ویکستید، د.، و مک‌آرت، س. راهنمای تصمیم‌گیری برای استفاده از آفت‌کش‌ها جهت محافظت از گرده‌افشان‌ها در باغ‌های درختان (دانشگاه کرنل، ۲۰۱۸).
ایوازاکی، جی. ام و هوگندورن، کی. قرار گرفتن زنبورها در معرض سموم غیرآفت‌کش: مروری بر روش‌ها و نتایج گزارش‌شده. کشاورزی. اکوسیستم. چهارشنبه. 314، 107423 (2021).
کوپیت ای‌ام، کلینگر ای، کاکس-فاستر دی‌ال، رامیرز آر‌ای. و پیتس-سینگر تی‌ال. تأثیر نوع عرضه و قرار گرفتن در معرض آفت‌کش‌ها بر رشد لارو Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). چهارشنبه. انتومور. 51، 240–251 (2022).
کوپیت ای ام و پیتس-سینگر تی ال، مسیرهای مواجهه با آفت‌کش‌ها در زنبورهای انفرادی لانه خالی. چهارشنبه. انتومور. 47، 499–510 (2018).
پان، ان‌تی و همکاران. یک پروتکل جدید زیست‌سنجی بلع برای ارزیابی سمیت آفت‌کش‌ها در زنبورهای بالغ باغی ژاپنی (Osmia cornifrons). علم. گزارش‌ها 10، 9517 (2020).