شناسایی و تجزیه و تحلیل بیان ژن در سطح ژنوم، فاکتورهای تنظیم رشد خردل تحت شرایط خشکسالی

توزیع فصلی بارش در استان گوئیژو ناهموار است و در بهار و تابستان بارندگی بیشتر است، اما نهال های کلزا در پاییز و زمستان مستعد تنش خشکی هستند که به طور جدی بر عملکرد تأثیر می گذارد. خردل یک محصول مخصوص دانه های روغنی است که عمدتاً در استان گوئیژو رشد می کند. تحمل به خشکی قوی دارد و در مناطق کوهستانی قابل کشت است. این یک منبع غنی از ژن های مقاوم به خشکی است. کشف ژن‌های مقاوم به خشکی برای بهبود واریته‌های خردل اهمیت حیاتی دارد. و نوآوری در منابع ژرم پلاسم. خانواده GRF نقش مهمی در رشد و نمو گیاهان و پاسخ به تنش خشکی ایفا می کند. در حال حاضر، ژن های GRF در Arabidopsis 2، برنج (Oryza sativa) 12، کلزا 13، پنبه (Gossypium hirsutum) 14، گندم (Triticum) یافت شده است. aestivum)15، ارزن مروارید (Setaria italica)16 و Brassica17، اما هیچ گزارشی مبنی بر شناسایی ژن GRF در خردل وجود ندارد. در این مطالعه، ژن‌های خانواده GRF خردل در سطح ژنومی شناسایی و ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی، روابط تکاملی، همسانی، نقوش حفاظت‌شده، ساختار ژن، تکثیر ژنی، عناصر سیس و مرحله نهال (مرحله چهار برگی) آن‌ها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. الگوهای بیان تحت تنش خشکی به طور جامع تجزیه و تحلیل شد تا مبنای علمی برای مطالعات بیشتر در مورد عملکرد بالقوه ژن‌های BjGRF در پاسخ به خشکی و ارائه ژن‌های کاندید برای پرورش خردل مقاوم به خشکی فراهم شود.
سی و چهار ژن BjGRF در ژنوم Brassica juncea با استفاده از دو جستجوی HMMER شناسایی شدند که همگی شامل دامنه‌های QLQ و WRC هستند. توالی های CDS ژن های BjGRF شناسایی شده در جدول تکمیلی S1 ارائه شده است. BjGRF01–BjGRF34 بر اساس مکان آنها در کروموزوم نامگذاری می شوند. خواص فیزیکوشیمیایی این خانواده نشان می دهد که طول اسید آمینه بسیار متغیر است و از 261 aa (BjGRF19) تا 905 aa (BjGRF28) متغیر است. نقطه ایزوالکتریک BjGRF از 6.19 (BjGRF02) تا 9.35 (BjGRF03) با میانگین 8.33 است و 88.24 درصد BjGRF یک پروتئین پایه است. محدوده وزن مولکولی پیش بینی شده BjGRF از 29.82 کیلو دالتون (BjGRF19) تا 102.90 کیلو دالتون (BjGRF28) است. شاخص ناپایداری پروتئین های BjGRF از 51.13 (BjGRF08) تا 78.24 (BjGRF19) متغیر است، که همگی بزرگتر از 40 هستند، که نشان می دهد شاخص اسید چرب از 43.65 (BjGRF01) تا 78.78 (BjGRFY22-hydrophlicity) متغیر است. (BjGRF31) تا -0.45 (BjGRF22)، تمام پروتئین های آبدوست BjGRF دارای مقادیر GRAVY منفی هستند که ممکن است به دلیل عدم آب گریزی ناشی از باقیمانده ها باشد. پیش‌بینی محلی‌سازی درون سلولی نشان داد که 31 پروتئین رمزگذاری‌شده BjGRF می‌تواند در هسته، BjGRF04 می‌تواند در پراکسی‌زوم‌ها، BjGRF25 می‌تواند در سیتوپلاسم و BjGRF28 می‌تواند در کلروپلاست موضعی شود (جدول 1)، که نشان می‌دهد که BjGRF ممکن است بازی محلی و تنظیم شده مهم باشد. نقش یک عامل رونویسی
تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک خانواده های GRF در گونه های مختلف می تواند به مطالعه عملکرد ژن کمک کند. بنابراین، توالی اسید آمینه تمام طول 35 دانه کلزا، 16 شلغم، 12 برنج، 10 ارزن و 9 آرابیدوپسیس GRF دانلود شد و یک درخت فیلوژنتیک بر اساس 34 ژن BjGRF شناسایی شده ساخته شد (شکل 1). این سه زیرخانواده دارای تعداد متفاوتی از اعضا هستند. 116 GRF TF به سه زیر خانواده مختلف (گروه های A~C) تقسیم می شوند که به ترتیب شامل 59 (50.86٪)، 34 (29.31٪) و 23 (19.83)٪ از GRF ها هستند. در میان آنها، 34 عضو خانواده BjGRF در 3 زیرخانواده پراکنده هستند: 13 عضو در گروه A (38.24%)، 12 عضو در گروه B (35.29%) و 9 عضو در گروه C (26.47%). در فرآیند پلی پلوئیدیزاسیون خردل، تعداد ژن های BjGRFs در زیرخانواده های مختلف متفاوت است و ممکن است تکثیر و از بین رفتن ژن رخ داده باشد. شایان ذکر است که در گروه C توزیع GRF برنج و ارزن وجود ندارد، در حالی که در گروه B 2 GRF برنج و 1 GRF ارزن وجود دارد و بیشتر GRF های برنج و ارزن در یک شاخه گروه بندی می شوند که نشان می دهد BjGRF ها با دو لپه ای ارتباط نزدیک دارند. در میان آنها، عمیق ترین مطالعات در مورد عملکرد GRF در Arabidopsis thaliana، مبنایی برای مطالعات عملکردی BjGRFs فراهم می کند.
درخت فیلوژنتیک خردل شامل Brassica napus، Brassica napus، برنج، ارزن و اعضای خانواده Arabidopsis thaliana GRF.
تجزیه و تحلیل ژن های تکراری در خانواده GRF خردل. خط خاکستری در پس زمینه نشان دهنده یک بلوک هماهنگ در ژنوم خردل است، خط قرمز نشان دهنده یک جفت تکرار قطعه بندی شده از ژن BjGRF است.
بیان ژن BjGRF تحت تنش خشکی در مرحله چهارم برگ داده های qRT-PCR در جدول تکمیلی S5 نشان داده شده است. تفاوت های قابل توجه در داده ها با حروف کوچک نشان داده می شود.
با ادامه تغییر آب و هوای جهانی، مطالعه چگونگی مقابله گیاهان با تنش خشکی و بهبود مکانیسم های تحمل آنها به یک موضوع تحقیقاتی داغ تبدیل شده است. پس از خشکسالی، ساختار مورفولوژیکی، بیان ژن و فرآیندهای متابولیکی گیاهان تغییر می کند که ممکن است منجر به توقف فتوسنتز و اختلال متابولیک شود و بر عملکرد و کیفیت محصولات تأثیر بگذارد. وقتی گیاهان سیگنال‌های خشکسالی را حس می‌کنند، پیام‌رسان‌های دوم مانند Ca2+ و فسفاتیدیل‌نوزیتول تولید می‌کنند، غلظت یون کلسیم داخل سلولی را افزایش می‌دهند و شبکه تنظیمی مسیر فسفوریلاسیون پروتئین را فعال می‌کنند. پروتئین هدف نهایی مستقیماً در دفاع سلولی نقش دارد یا بیان ژن‌های استرس مرتبط را از طریق TFs تنظیم می‌کند و تحمل گیاه را در برابر استرس افزایش می‌دهد. بنابراین، TF ها نقش مهمی در پاسخ به تنش خشکی ایفا می کنند. با توجه به توالی و خواص اتصال DNA TFهای پاسخگو به تنش خشکی، TFها را می توان به خانواده های مختلفی مانند GRF، ERF، MYB، WRKY و سایر خانواده ها تقسیم کرد.
خانواده ژن GRF نوعی TF مخصوص گیاه است که نقش مهمی در جنبه های مختلف مانند رشد، نمو، انتقال سیگنال و پاسخ های دفاعی گیاه ایفا می کند. از زمانی که اولین ژن GRF در O. sativa28 شناسایی شد، ژن‌های GRF بیشتری در بسیاری از گونه‌ها شناسایی شده‌اند و نشان داده شده‌اند که بر رشد، نمو و پاسخ به تنش گیاه تأثیر می‌گذارند8، 29، 30،31،32. با انتشار توالی ژنوم Brassica juncea، شناسایی خانواده ژن BjGRF امکان پذیر شد33. در این مطالعه 34 ژن BjGRF در کل ژنوم خردل شناسایی شد و بر اساس موقعیت کروموزومی آنها BjGRF01–BjGRF34 نامگذاری شد. همه آنها حاوی دامنه های QLQ و WRC بسیار حفاظت شده هستند. تجزیه و تحلیل خواص فیزیکوشیمیایی نشان داد که تفاوت در تعداد اسید آمینه و وزن مولکولی پروتئین‌های BjGRF (به جز BjGRF28) معنی‌دار نبود، که نشان می‌دهد اعضای خانواده BjGRF ممکن است عملکردهای مشابهی داشته باشند. تجزیه و تحلیل ساختار ژن نشان داد که 64.7 درصد از ژن های BjGRF حاوی 4 اگزون است که نشان می دهد ساختار ژن BjGRF در تکامل نسبتاً حفظ شده است، اما تعداد اگزون ها در ژن های BjGRF10، BjGRF16، BjGRP28 و BjGRF29 بیشتر است. مطالعات نشان داده اند که افزودن یا حذف اگزون ها یا اینترون ها می تواند منجر به تفاوت هایی در ساختار و عملکرد ژن شود و در نتیجه ژن های جدید ایجاد شود. بنابراین، ما حدس می زنیم که اینترون BjGRF در طول تکامل از بین رفته است، که ممکن است باعث تغییرات در عملکرد ژن شود. مطابق با مطالعات موجود، ما همچنین دریافتیم که تعداد اینترون ها با بیان ژن مرتبط است. هنگامی که تعداد اینترون ها در یک ژن زیاد باشد، ژن می تواند به سرعت به عوامل مختلف نامطلوب پاسخ دهد.
تکثیر ژن عامل اصلی در تکامل ژنومی و ژنتیکی است. مطالعات مرتبط نشان داده‌اند که تکرار ژن نه تنها تعداد ژن‌های GRF را افزایش می‌دهد، بلکه به عنوان وسیله‌ای برای تولید ژن‌های جدید برای کمک به گیاهان برای سازگاری با شرایط مختلف محیطی نامطلوب عمل می‌کند. در مجموع 48 جفت ژن تکراری در این مطالعه یافت شد که همگی تکرارهای سگمنتال بودند که نشان می دهد تکرارهای سگمنتال مکانیسم اصلی افزایش تعداد ژن ها در این خانواده است. در ادبیات گزارش شده است که تکثیر سگمنتال می تواند به طور موثری باعث تقویت اعضای خانواده ژن GRF در آرابیدوپسیس و توت فرنگی شود و هیچ تکراری پشت سر هم از این خانواده ژنی در هیچ یک از گونه ها یافت نشد27،39. نتایج این مطالعه با مطالعات موجود بر روی خانواده‌های آرابیدوپسیس تالیانا و توت‌فرنگی مطابقت دارد و نشان می‌دهد که خانواده GRF می‌تواند تعداد ژن‌ها را افزایش داده و ژن‌های جدید را از طریق تکثیر قطعه‌ای در گیاهان مختلف تولید کند.
در این مطالعه مجموعاً 34 ژن BjGRF در خردل شناسایی شد که به 3 زیر خانواده تقسیم شدند. این ژن‌ها موتیف‌ها و ساختارهای ژنی حفظ‌شده مشابهی را نشان دادند. تجزیه و تحلیل هم خطی، 48 جفت قطعه تکراری را در خردل نشان داد. ناحیه پروموتر BjGRF حاوی عناصر سیس-اثر مرتبط با پاسخ نور، پاسخ هورمونی، پاسخ استرس محیطی، و رشد و نمو است. بیان 34 ژن BjGRF در مرحله نهال خردل (ریشه، ساقه، برگ) و الگوی بیان 10 ژن BjGRF در شرایط خشکی شناسایی شد. مشخص شد که الگوهای بیان ژن‌های BjGRF تحت تنش خشکی مشابه بوده و ممکن است مشابه باشند. دخالت در تنظیم اجباری خشکسالی ژن های BjGRF03 و BjGRF32 ممکن است نقش های تنظیمی مثبتی در تنش خشکی ایفا کنند، در حالی که BjGRF06 و BjGRF23 به عنوان ژن های هدف miR396 در تنش خشکی نقش دارند. به طور کلی، مطالعه ما یک مبنای بیولوژیکی برای کشف آینده عملکرد ژن BjGRF در گیاهان Brassicaceae فراهم می کند.
دانه‌های خردل مورد استفاده در این آزمایش توسط موسسه تحقیقات دانه‌های روغنی گوئیژو، آکادمی علوم کشاورزی گوئیژو تهیه شد. بذرها را کامل انتخاب کرده و در خاک بکارید (سوبسترا: خاک = 3:1) و پس از مرحله چهار برگی ریشه، ساقه و برگ را جمع آوری کنید. گیاهان برای شبیه سازی خشکی با 20 درصد PEG 6000 تیمار شدند و برگ ها پس از 0، 3، 6، 12 و 24 ساعت جمع آوری شدند. تمام نمونه های گیاهی بلافاصله در نیتروژن مایع منجمد شدند و سپس برای آزمایش بعدی در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
کلیه داده های به دست آمده یا تجزیه و تحلیل شده در این مطالعه در مقاله منتشر شده و فایل های اطلاعات تکمیلی گنجانده شده است.