شناسایی و تجزیه و تحلیل بیان ژن در سطح ژنوم، فاکتورهای تنظیم رشد خردل تحت شرایط خشکسالی

توزیع فصلی بارندگی در استان گوئیژو ناهموار است و بارندگی بیشتر در بهار و تابستان است، اما نهال‌های کلزا در پاییز و زمستان مستعد تنش خشکی هستند که به طور جدی بر عملکرد تأثیر می‌گذارد. خردل یک محصول دانه روغنی خاص است که عمدتاً در استان گوئیژو کشت می‌شود. این گیاه تحمل خشکی بالایی دارد و می‌تواند در مناطق کوهستانی کشت شود. این گیاه منبع غنی از ژن‌های مقاوم به خشکی است. کشف ژن‌های مقاوم به خشکی برای بهبود گونه‌های خردل و نوآوری در منابع ژرم‌پلاسم از اهمیت حیاتی برخوردار است. خانواده GRF نقش مهمی در رشد و نمو گیاه و پاسخ به تنش خشکی ایفا می‌کنند. در حال حاضر، ژن‌های GRF در Arabidopsis 2، برنج (Oryza sativa) 12، کلزا 13، پنبه (Gossypium hirsutum) 14، گندم (Triticum aestivum) 15، ارزن مرواریدی (Setaria italica) 16 و Brassica 17 یافت شده‌اند، اما هیچ گزارشی از شناسایی ژن‌های GRF در خردل وجود ندارد. در این مطالعه، ژن‌های خانواده GRF خردل در سطح ژنوم شناسایی شدند و ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی، روابط تکاملی، همولوژی، موتیف‌های حفظ‌شده، ساختار ژن، مضاعف‌شدگی ژن، عناصر سیس و مرحله گیاهچه (مرحله چهار برگی) آنها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. الگوهای بیان تحت تنش خشکی به طور جامع تجزیه و تحلیل شدند تا مبنای علمی برای مطالعات بیشتر در مورد عملکرد بالقوه ژن‌های BjGRF در پاسخ به خشکی و ارائه ژن‌های کاندید برای اصلاح خردل مقاوم به خشکی فراهم شود.
سی و چهار ژن BjGRF با استفاده از دو جستجوی HMMER در ژنوم Brassica juncea شناسایی شدند که همگی حاوی دامنه‌های QLQ و WRC هستند. توالی‌های CDS ژن‌های شناسایی شده BjGRF در جدول تکمیلی S1 ارائه شده‌اند. BjGRF01-BjGRF34 بر اساس موقعیت آنها روی کروموزوم نامگذاری شده‌اند. خواص فیزیکوشیمیایی این خانواده نشان می‌دهد که طول اسید آمینه بسیار متغیر است و از 261 اسید آمینه (BjGRF19) تا 905 اسید آمینه (BjGRF28) متغیر است. نقطه ایزوالکتریک BjGRF از 6.19 (BjGRF02) تا 9.35 (BjGRF03) با میانگین 8.33 متغیر است و 88.24٪ از BjGRF یک پروتئین بازی است. محدوده وزن مولکولی پیش‌بینی‌شده BjGRF از 29.82 کیلو دالتون (BjGRF19) تا 102.90 کیلو دالتون (BjGRF28) است؛ شاخص ناپایداری پروتئین‌های BjGRF از 51.13 (BjGRF08) تا 78.24 (BjGRF19) متغیر است که همگی بزرگتر از 40 هستند، که نشان می‌دهد شاخص اسید چرب از 43.65 (BjGRF01) تا 78.78 (BjGRF22) متغیر است، میانگین آب‌دوستی (GRAVY) از -1.07 (BjGRF31) تا -0.45 (BjGRF22) متغیر است، تمام پروتئین‌های آب‌دوست BjGRF دارای مقادیر GRAVY منفی هستند که ممکن است به دلیل عدم آب‌گریزی ناشی از باقیمانده‌ها باشد. پیش‌بینی محلی‌سازی زیرسلولی نشان داد که 31 پروتئین کد شده توسط BjGRF می‌توانند در هسته، BjGRF04 می‌توانند در پراکسی‌زوم‌ها، BjGRF25 می‌توانند در سیتوپلاسم و BjGRF28 می‌توانند در کلروپلاست‌ها قرار گیرند (جدول 1)، که نشان می‌دهد BjGRFها ممکن است در هسته قرار داشته باشند و نقش تنظیمی مهمی را به عنوان یک فاکتور رونویسی ایفا کنند.
تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک خانواده‌های GRF در گونه‌های مختلف می‌تواند به مطالعه عملکرد ژن‌ها کمک کند. بنابراین، توالی کامل اسید آمینه 35 GRF کلزا، 16 شلغم، 12 برنج، 10 ارزن و 9 GRF آرابیدوپسیس دانلود شد و یک درخت فیلوژنتیک بر اساس 34 ژن شناسایی شده BjGRF ساخته شد (شکل 1). سه زیرخانواده شامل تعداد اعضای متفاوتی هستند؛ 116 TF GRF به سه زیرخانواده مختلف (گروه‌های A~C) تقسیم می‌شوند که به ترتیب شامل 59 (50.86%)، 34 (29.31%) و 23 (19.83)% از GRFها هستند. در میان آنها، 34 عضو خانواده BjGRF در 3 زیرخانواده پراکنده شده‌اند: 13 عضو در گروه A (38.24%)، 12 عضو در گروه B (35.29%) و 9 عضو در گروه C (26.47%). در فرآیند پلی‌پلوئیدی شدن خردل، تعداد ژن‌های BjGRF در زیرخانواده‌های مختلف متفاوت است و ممکن است تکثیر و از دست دادن ژن رخ داده باشد. شایان ذکر است که هیچ توزیعی از GRF های برنج و ارزن در گروه C وجود ندارد، در حالی که در گروه B، 2 GRF برنج و 1 GRF ارزن وجود دارد و بیشتر GRF های برنج و ارزن در یک شاخه گروه‌بندی می‌شوند که نشان می‌دهد BjGRF ها ارتباط نزدیکی با گیاهان دو لپه‌ای دارند. در میان آنها، عمیق‌ترین مطالعات روی عملکرد GRF در Arabidopsis thaliana مبنایی برای مطالعات عملکردی BjGRF ها فراهم می‌کند.
درخت فیلوژنتیک خردل شامل Brassica napus، Brassica napus، برنج، ارزن و اعضای خانواده GRF گیاه Arabidopsis thaliana.
تحلیل ژن‌های تکراری در خانواده GRF خردل. خط خاکستری در پس‌زمینه نشان‌دهنده یک بلوک هماهنگ در ژنوم خردل است، خط قرمز نشان‌دهنده یک جفت تکرار قطعه قطعه شده از ژن BjGRF است؛
بیان ژن BjGRF تحت تنش خشکی در مرحله برگ چهارم. داده‌های qRT-PCR در جدول تکمیلی S5 نشان داده شده است. تفاوت‌های معنی‌دار در داده‌ها با حروف کوچک نشان داده شده است.
با ادامه تغییرات اقلیمی جهانی، مطالعه چگونگی مقابله محصولات کشاورزی با تنش خشکی و بهبود مکانیسم‌های تحمل آنها به یک موضوع تحقیقاتی داغ تبدیل شده است18. پس از خشکسالی، ساختار مورفولوژیکی، بیان ژن و فرآیندهای متابولیکی گیاهان تغییر خواهد کرد که ممکن است منجر به توقف فتوسنتز و اختلال متابولیکی شود و بر عملکرد و کیفیت محصولات کشاورزی تأثیر بگذارد19،20،21. هنگامی که گیاهان سیگنال‌های خشکسالی را حس می‌کنند، پیام‌رسان‌های ثانویه مانند Ca2+ و فسفاتیدیل اینوزیتول تولید می‌کنند، غلظت یون کلسیم درون سلولی را افزایش می‌دهند و شبکه تنظیمی مسیر فسفوریلاسیون پروتئین را فعال می‌کنند22،23. پروتئین هدف نهایی مستقیماً در دفاع سلولی دخیل است یا بیان ژن‌های مرتبط با تنش را از طریق فاکتورهای رونویسی تنظیم می‌کند و تحمل گیاه را به تنش افزایش می‌دهد24،25. بنابراین، فاکتورهای رونویسی نقش حیاتی در پاسخ به تنش خشکی دارند. بر اساس توالی و خواص اتصال DNA فاکتورهای رونویسی پاسخگو به تنش خشکی، فاکتورهای رونویسی را می‌توان به خانواده‌های مختلفی مانند GRF، ERF، MYB، WRKY و سایر خانواده‌ها تقسیم کرد26.
خانواده ژن GRF نوعی از TF مخصوص گیاه است که نقش‌های مهمی در جنبه‌های مختلف مانند رشد، نمو، انتقال سیگنال و پاسخ‌های دفاعی گیاه ایفا می‌کند27. از زمانی که اولین ژن GRF در O. sativa28 شناسایی شد، ژن‌های GRF بیشتر و بیشتری در بسیاری از گونه‌ها شناسایی شده و نشان داده شده است که بر رشد، نمو و پاسخ به تنش گیاه تأثیر می‌گذارند8، 29، 30، 31، 32. با انتشار توالی ژنوم Brassica juncea، شناسایی خانواده ژن BjGRF امکان‌پذیر شد33. در این مطالعه، 34 ژن BjGRF در کل ژنوم خردل شناسایی و بر اساس موقعیت کروموزومی آنها BjGRF01-BjGRF34 نامگذاری شدند. همه آنها حاوی دامنه‌های QLQ و WRC بسیار حفاظت‌شده هستند. تجزیه و تحلیل خواص فیزیکوشیمیایی نشان داد که تفاوت در تعداد اسیدهای آمینه و وزن مولکولی پروتئین‌های BjGRF (به جز BjGRF28) معنی‌دار نبود، که نشان می‌دهد اعضای خانواده BjGRF ممکن است عملکردهای مشابهی داشته باشند. تجزیه و تحلیل ساختار ژن نشان داد که 64.7٪ از ژن‌های BjGRF حاوی 4 اگزون هستند که نشان می‌دهد ساختار ژن BjGRF در تکامل نسبتاً حفظ شده است، اما تعداد اگزون‌ها در ژن‌های BjGRF10، BjGRF16، BjGRP28 و BjGRF29 بیشتر است. مطالعات نشان داده‌اند که اضافه یا حذف اگزون‌ها یا اینترون‌ها می‌تواند منجر به تفاوت در ساختار و عملکرد ژن شود و در نتیجه ژن‌های جدیدی ایجاد کند34،35،36. بنابراین، ما حدس می‌زنیم که اینترون BjGRF در طول تکامل از بین رفته است، که ممکن است باعث تغییراتی در عملکرد ژن شود. مطابق با مطالعات موجود، ما همچنین دریافتیم که تعداد اینترون‌ها با بیان ژن مرتبط است. هنگامی که تعداد اینترون‌ها در یک ژن زیاد باشد، ژن می‌تواند به سرعت به عوامل نامطلوب مختلف پاسخ دهد.
تکثیر ژن عامل اصلی در تکامل ژنومی و ژنتیکی است37. مطالعات مرتبط نشان داده‌اند که تکثیر ژن نه تنها تعداد ژن‌های GRF را افزایش می‌دهد، بلکه به عنوان وسیله‌ای برای تولید ژن‌های جدید برای کمک به گیاهان در سازگاری با شرایط نامساعد محیطی مختلف عمل می‌کند38. در مجموع 48 جفت ژن تکراری در این مطالعه یافت شد که همگی تکثیر قطعه‌ای بودند، که نشان می‌دهد تکثیر قطعه‌ای مکانیسم اصلی افزایش تعداد ژن‌ها در این خانواده است. در مقالات گزارش شده است که تکثیر قطعه‌ای می‌تواند به طور مؤثر تکثیر اعضای خانواده ژن GRF را در Arabidopsis و توت‌فرنگی افزایش دهد و هیچ تکثیر پشت سر هم از این خانواده ژنی در هیچ یک از گونه‌ها یافت نشد27،39. نتایج این مطالعه با مطالعات موجود در مورد خانواده‌های Arabidopsis thaliana و توت‌فرنگی مطابقت دارد، که نشان می‌دهد خانواده GRF می‌تواند تعداد ژن‌ها را افزایش داده و از طریق تکثیر قطعه‌ای در گیاهان مختلف ژن‌های جدیدی تولید کند.
در این مطالعه، در مجموع 34 ژن BjGRF در خردل شناسایی شد که به 3 زیرخانواده تقسیم شدند. این ژن‌ها موتیف‌های حفاظت‌شده و ساختارهای ژنی مشابهی را نشان دادند. تجزیه و تحلیل هم‌خطی، 48 جفت تکرار قطعه را در خردل نشان داد. ناحیه پروموتر BjGRF حاوی عناصر سیس-اکتیو مرتبط با پاسخ به نور، پاسخ هورمونی، پاسخ به تنش محیطی و رشد و نمو است. بیان 34 ژن BjGRF در مرحله گیاهچه خردل (ریشه، ساقه، برگ) و الگوی بیان 10 ژن BjGRF در شرایط خشکسالی شناسایی شد. مشخص شد که الگوهای بیان ژن‌های BjGRF تحت تنش خشکی مشابه بوده و ممکن است مشابه باشند. دخالت در تنظیم تنش خشکی. ژن‌های BjGRF03 و BjGRF32 ممکن است نقش‌های تنظیمی مثبتی در تنش خشکی ایفا کنند، در حالی که BjGRF06 و BjGRF23 به عنوان ژن‌های هدف miR396 در تنش خشکی نقش دارند. به طور کلی، مطالعه ما مبنای بیولوژیکی برای کشف آینده عملکرد ژن BjGRF در گیاهان خانواده Brassicaceae فراهم می‌کند.
دانه‌های خردل مورد استفاده در این آزمایش توسط موسسه تحقیقات دانه‌های روغنی گوئیژو، آکادمی علوم کشاورزی گوئیژو تهیه شدند. دانه‌های کامل را انتخاب کرده و آنها را در خاک (سوبسترا: خاک = 3:1) بکارید و ریشه‌ها، ساقه‌ها و برگ‌ها را پس از مرحله چهار برگی جمع‌آوری کنید. گیاهان برای شبیه‌سازی خشکسالی با 20٪ PEG 6000 تیمار شدند و برگ‌ها پس از 0، 3، 6، 12 و 24 ساعت جمع‌آوری شدند. همه نمونه‌های گیاهی بلافاصله در نیتروژن مایع منجمد شده و سپس برای آزمایش بعدی در فریزر -80 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
تمام داده‌های به‌دست‌آمده یا تحلیل‌شده در طول این مطالعه در مقاله منتشرشده و فایل‌های اطلاعات تکمیلی گنجانده شده است.