فعالیت لاروکشی و ضد موریانه بیوسورفکتانت‌های میکروبی تولید شده توسط Enterobacter cloacae SJ2 جدا شده از اسفنج Clathria sp.

استفاده گسترده از آفت‌کش‌های مصنوعی منجر به مشکلات زیادی از جمله ظهور ارگانیسم‌های مقاوم، تخریب محیط زیست و آسیب به سلامت انسان شده است. بنابراین، میکروب‌های جدیدآفت‌کش‌هاکه برای سلامت انسان و محیط زیست بی‌خطر باشند، به شدت مورد نیاز هستند. در این مطالعه، بیوسورفکتانت رامنولیپید تولید شده توسط Enterobacter cloacae SJ2 برای ارزیابی سمیت بر لارو پشه (Culex quinquefasciatus) و موریانه (Odontotermes obesus) مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان مرگ و میر وابسته به دوز بین تیمارها وجود دارد. مقدار LC50 (غلظت کشنده 50٪) در 48 ساعت برای بیوسورفکتانت‌های لارو موریانه و پشه با استفاده از روش برازش منحنی رگرسیون غیرخطی تعیین شد. نتایج نشان داد که مقادیر LC50 48 ساعته (فاصله اطمینان 95٪) فعالیت لاروکشی و ضد موریانه بیوسورفکتانت به ترتیب 26.49 میلی‌گرم در لیتر (محدوده 25.40 تا 27.57) و 33.43 میلی‌گرم در لیتر (محدوده 31.09 تا 35.68) بود. طبق بررسی هیستوپاتولوژیک، تیمار با بیوسورفکتانت‌ها باعث آسیب شدید به بافت‌های اندامک لاروها و موریانه‌ها شد. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که بیوسورفکتانت میکروبی تولید شده توسط Enterobacter cloacae SJ2 ابزاری عالی و بالقوه مؤثر برای کنترل Cx است. quinquefasciatus و O. obesus.
کشورهای گرمسیری تعداد زیادی از بیماری‌های منتقله از طریق پشه را تجربه می‌کنند.1. اهمیت بیماری‌های منتقله از طریق پشه گسترده است. سالانه بیش از 400000 نفر بر اثر مالاریا جان خود را از دست می‌دهند و برخی از شهرهای بزرگ شاهد اپیدمی بیماری‌های جدی مانند تب دنگی، تب زرد، چیکونگونیا و زیکا هستند.2 بیماری‌های منتقله از طریق ناقلین با یک مورد از هر شش عفونت در سراسر جهان مرتبط هستند و پشه‌ها عامل مهمترین موارد هستند.3،4. کولکس، آنوفل و آئدس سه جنس پشه هستند که بیشتر با انتقال بیماری مرتبط هستند.5. شیوع تب دنگی، عفونتی که توسط پشه آئدس آجیپتی منتقل می‌شود، در طول دهه گذشته افزایش یافته و تهدید قابل توجهی برای سلامت عمومی محسوب می‌شود.4،7،8. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی (WHO)، بیش از 40٪ از جمعیت جهان در معرض خطر تب دنگی هستند و سالانه 50 تا 100 میلیون مورد جدید در بیش از 100 کشور رخ می‌دهد.9،10،11. تب دنگی با افزایش شیوع آن در سراسر جهان به یک مشکل عمده بهداشت عمومی تبدیل شده است12،13،14. آنوفل گامبیا، که معمولاً به عنوان پشه آنوفل آفریقایی شناخته می‌شود، مهمترین ناقل مالاریای انسانی در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری است15. ویروس نیل غربی، آنسفالیت سنت لوئیس، آنسفالیت ژاپنی و عفونت‌های ویروسی اسب‌ها و پرندگان توسط پشه‌های کولکس که اغلب پشه‌های خانگی معمولی نامیده می‌شوند، منتقل می‌شوند. علاوه بر این، آنها همچنین ناقل بیماری‌های باکتریایی و انگلی هستند16. بیش از 3000 گونه موریانه در جهان وجود دارد و بیش از 150 میلیون سال است که وجود دارند17. اکثر آفات در خاک زندگی می‌کنند و از چوب و محصولات چوبی حاوی سلولز تغذیه می‌کنند. موریانه هندی Odontotermes obesus یک آفت مهم است که باعث آسیب شدید به محصولات مهم و درختان کاشته شده می‌شود18. در مناطق کشاورزی، هجوم موریانه‌ها در مراحل مختلف می‌تواند خسارات اقتصادی زیادی به محصولات مختلف، گونه‌های درختی و مصالح ساختمانی وارد کند. موریانه‌ها همچنین می‌توانند باعث مشکلات سلامتی انسان شوند19.
مسئله مقاومت میکروارگانیسم‌ها و آفات در زمینه‌های دارویی و کشاورزی امروزی پیچیده است20،21. بنابراین، هر دو شرکت باید به دنبال ضد میکروب‌های جدید مقرون به صرفه و آفت‌کش‌های زیستی ایمن باشند. آفت‌کش‌های مصنوعی اکنون در دسترس هستند و نشان داده شده است که عفونی هستند و حشرات مفید غیرهدف را دفع می‌کنند22. در سال‌های اخیر، تحقیقات در مورد بیوسورفکتانت‌ها به دلیل کاربرد آنها در صنایع مختلف گسترش یافته است. بیوسورفکتانت‌ها در کشاورزی، اصلاح خاک، استخراج نفت، حذف باکتری‌ها و حشرات و فرآوری مواد غذایی بسیار مفید و حیاتی هستند23،24. بیوسورفکتانت‌ها یا سورفکتانت‌های میکروبی، مواد شیمیایی بیوسورفکتانت هستند که توسط میکروارگانیسم‌هایی مانند باکتری‌ها، مخمرها و قارچ‌ها در زیستگاه‌های ساحلی و مناطق آلوده به نفت تولید می‌شوند25،26. سورفکتانت‌های مشتق شده شیمیایی و بیوسورفکتانت‌ها دو نوع هستند که مستقیماً از محیط طبیعی به دست می‌آیند27. بیوسورفکتانت‌های مختلفی از زیستگاه‌های دریایی به دست می‌آیند28،29. بنابراین، دانشمندان به دنبال فناوری‌های جدیدی برای تولید بیوسورفکتانت‌ها بر اساس باکتری‌های طبیعی هستند30،31. پیشرفت در چنین تحقیقاتی اهمیت این ترکیبات بیولوژیکی را برای حفاظت از محیط زیست نشان می‌دهد32. باسیلوس، سودوموناس، رودوکوکوس، آلکالیژنز، کورینه باکتریوم و این جنس‌های باکتریایی، نمایندگان شناخته‌شده‌ای هستند23،33.
انواع مختلفی از بیوسورفکتانت‌ها با طیف وسیعی از کاربردها وجود دارد34. مزیت قابل توجه این ترکیبات این است که برخی از آنها فعالیت ضد باکتری، لاروکشی و حشره‌کشی دارند. این بدان معناست که می‌توان از آنها در صنایع کشاورزی، شیمیایی، دارویی و آرایشی استفاده کرد35،36،37،38. از آنجا که بیوسورفکتانت‌ها عموماً زیست‌تخریب‌پذیر و از نظر زیست‌محیطی مفید هستند، در برنامه‌های مدیریت تلفیقی آفات برای محافظت از محصولات کشاورزی استفاده می‌شوند39. بنابراین، دانش اولیه در مورد فعالیت لاروکشی و ضد موریانه بیوسورفکتانت‌های میکروبی تولید شده توسط Enterobacter cloacae SJ2 به دست آمده است. ما میزان مرگ و میر و تغییرات بافت‌شناسی را هنگام قرار گرفتن در معرض غلظت‌های مختلف بیوسورفکتانت‌های رامنولیپید بررسی کردیم. علاوه بر این، ما برنامه کامپیوتری ساختار-فعالیت کمی (QSAR) و فعالیت-فعالیت اکولوژیکی (ECOSAR) را که به طور گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرد، برای تعیین سمیت حاد برای ریزجلبک‌ها، دافنی‌ها و ماهی‌ها ارزیابی کردیم.
در این مطالعه، فعالیت ضد موریانه (سمیت) بیوسورفکتانت‌های خالص‌شده در غلظت‌های مختلف از 30 تا 50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر (با فواصل 5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) علیه موریانه‌های هندی، O. obesus و گونه چهارم (ارزیابی لاروهای سن Cx. لارو پشه‌های quinquefasciatus) آزمایش شد. غلظت‌های LC50 بیوسورفکتانت طی 48 ساعت علیه O. obesus و Cx. C. solanacearum اندازه‌گیری شد. لاروهای پشه با استفاده از روش برازش منحنی رگرسیون غیرخطی شناسایی شدند. نتایج نشان داد که مرگ و میر موریانه‌ها با افزایش غلظت بیوسورفکتانت افزایش می‌یابد. نتایج نشان داد که بیوسورفکتانت دارای فعالیت لاروکشی (شکل 1) و فعالیت ضد موریانه (شکل 2) است، با مقادیر LC50 48 ساعته (95% CI) به ترتیب 26.49 میلی‌گرم در لیتر (25.40 تا 27.57) و 33.43 میلی‌گرم در لیتر (شکل 31.09 تا 35.68) (جدول 1). از نظر سمیت حاد (48 ساعت)، بیوسورفکتانت برای ارگانیسم‌های آزمایش شده به عنوان "مضر" طبقه‌بندی می‌شود. بیوسورفکتانت تولید شده در این مطالعه فعالیت لاروکشی عالی با 100٪ مرگ و میر در عرض 24 تا 48 ساعت پس از قرار گرفتن در معرض آن نشان داد.
مقدار LC50 را برای فعالیت لاروکشی محاسبه کنید. برازش منحنی رگرسیون غیرخطی (خط ممتد) و فاصله اطمینان 95٪ (ناحیه سایه‌دار) برای مرگ و میر نسبی (%).
مقدار LC50 را برای فعالیت ضد موریانه محاسبه کنید. برازش منحنی رگرسیون غیرخطی (خط ممتد) و فاصله اطمینان 95٪ (ناحیه سایه‌دار) برای مرگ و میر نسبی (%).
در پایان آزمایش، تغییرات مورفولوژیکی و ناهنجاری‌ها در زیر میکروسکوپ مشاهده شد. تغییرات مورفولوژیکی در گروه‌های کنترل و تیمار شده با بزرگنمایی 40 برابر مشاهده شد. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، اختلال رشد در اکثر لاروهای تیمار شده با بیوسورفکتانت‌ها رخ داده است. شکل 3a یک Cx. quinquefasciatus طبیعی و شکل 3b یک Cx. غیرطبیعی را نشان می‌دهد که باعث ایجاد پنج لارو نماتد می‌شود.
تأثیر دوزهای زیرکشنده (LC50) بیوسورفکتانت‌ها بر رشد لاروهای Culex quinquefasciatus. تصویر میکروسکوپ نوری (الف) از یک Cx طبیعی با بزرگنمایی 40 برابر. quinquefasciatus (ب) Cx غیرطبیعی. باعث ایجاد پنج لارو نماتد می‌شود.
در مطالعه حاضر، بررسی بافت‌شناسی لاروهای تیمار شده (شکل 4) و موریانه‌ها (شکل 5) چندین ناهنجاری از جمله کاهش مساحت شکم و آسیب به عضلات، لایه‌های اپیتلیال و پوست و روده میانی را نشان داد. بافت‌شناسی مکانیسم فعالیت مهاری بیوسورفکتانت مورد استفاده در این مطالعه را آشکار کرد.
هیستوپاتولوژی لاروهای سن چهارم Cx نرمال درمان نشده. لاروهای quinquefasciatus (کنترل: (a، b)) و درمان شده با بیوسورفکتانت (درمان: (c، d)). فلش‌ها نشان دهنده اپیتلیوم روده (epi)، هسته‌ها (n) و ماهیچه (mu) درمان شده هستند. نوار = 50 میکرومتر.
هیستوپاتولوژی ماهی O. obesus معمولی درمان نشده (کنترل: (a، b)) و ماهی درمان شده با بیوسورفکتانت (تیمار: (c، d)). فلش‌ها به ترتیب نشان دهنده اپیتلیوم روده (epi) و عضله (mu) هستند. نوار = 50 میکرومتر.
در این مطالعه، از ECOSAR برای پیش‌بینی سمیت حاد محصولات بیوسورفکتانت رامنولیپید برای تولیدکنندگان اولیه (جلبک‌های سبز)، مصرف‌کنندگان اولیه (کک‌های آبی) و مصرف‌کنندگان ثانویه (ماهی‌ها) استفاده شد. این برنامه از مدل‌های پیچیده کمی ترکیب ساختار-فعالیت برای ارزیابی سمیت بر اساس ساختار مولکولی استفاده می‌کند. این مدل از نرم‌افزار ساختار-فعالیت (SAR) برای محاسبه سمیت حاد و طولانی‌مدت مواد برای گونه‌های آبزی استفاده می‌کند. به طور خاص، جدول 2 میانگین غلظت کشنده تخمینی (LC50) و میانگین غلظت مؤثر (EC50) را برای چندین گونه خلاصه می‌کند. سمیت مشکوک با استفاده از سیستم هماهنگ جهانی طبقه‌بندی و برچسب‌گذاری مواد شیمیایی (جدول 3) در چهار سطح طبقه‌بندی شد.
کنترل بیماری‌های منتقله از طریق ناقلین، به ویژه گونه‌های پشه‌ها و پشه‌های آئدس. مصری‌ها، اکنون کار دشواری دارند 40،41،42،43،44،45،46. اگرچه برخی از آفت‌کش‌های شیمیایی موجود، مانند پیرتروئیدها و ارگانوفسفات‌ها، تا حدودی مفید هستند، اما خطرات قابل توجهی برای سلامت انسان، از جمله دیابت، اختلالات تولید مثلی، اختلالات عصبی، سرطان و بیماری‌های تنفسی ایجاد می‌کنند. علاوه بر این، با گذشت زمان، این حشرات می‌توانند در برابر آنها مقاوم شوند13،43،48. بنابراین، اقدامات کنترل بیولوژیکی مؤثر و سازگار با محیط زیست به روشی محبوب‌تر برای کنترل پشه‌ها تبدیل خواهد شد49،50. بنلی51 اظهار داشت که کنترل زودهنگام پشه‌های ناقل در مناطق شهری مؤثرتر خواهد بود، اما استفاده از لاروکش‌ها را در مناطق روستایی توصیه نکردند52. تام و همکاران 53 همچنین اظهار داشتند که کنترل پشه‌ها در مراحل نابالغ آنها یک استراتژی ایمن و ساده خواهد بود زیرا آنها نسبت به عوامل کنترل حساس‌تر هستند 54.
تولید بیوسورفکتانت توسط یک سویه قوی (Enterobacter cloacae SJ2) اثربخشی پایدار و امیدوارکننده‌ای را نشان داد. مطالعه قبلی ما گزارش داد که Enterobacter cloacae SJ2 تولید بیوسورفکتانت را با استفاده از پارامترهای فیزیکوشیمیایی بهینه می‌کند26. طبق مطالعه آنها، شرایط بهینه برای تولید بیوسورفکتانت توسط یک جدایه بالقوه E. cloacae شامل انکوباسیون به مدت 36 ساعت، هم زدن در 150 دور در دقیقه، pH 7.5، 37 درجه سانتیگراد، شوری 1 ppt، 2٪ گلوکز به عنوان منبع کربن، 1٪ مخمر بود. عصاره به عنوان منبع نیتروژن برای به دست آوردن 2.61 گرم در لیتر بیوسورفکتانت استفاده شد. علاوه بر این، بیوسورفکتانت‌ها با استفاده از TLC، FTIR و MALDI-TOF-MS مشخص شدند. این امر تأیید کرد که رامنولیپید یک بیوسورفکتانت است. بیوسورفکتانت‌های گلیکولیپیدی، بیشترین مطالعه را در بین انواع دیگر بیوسورفکتانت‌ها دارند55. آنها از بخش‌های کربوهیدراتی و لیپیدی، عمدتاً زنجیره‌های اسید چرب، تشکیل شده‌اند. در میان گلیکولیپیدها، نمایندگان اصلی رامنولیپید و سوفورولیپید هستند56. رامنولیپیدها حاوی دو بخش رامنوز متصل به مونو یا دی بتا هیدروکسی دکانوئیک اسید هستند57. استفاده از رامنولیپیدها در صنایع پزشکی و داروسازی به خوبی تثبیت شده است58، علاوه بر این، اخیراً به عنوان آفت‌کش نیز استفاده می‌شوند59.
برهمکنش بیوسورفکتانت با ناحیه آبگریز سیفون تنفسی، امکان عبور آب از حفره روزنه آن را فراهم می‌کند و در نتیجه تماس لاروها با محیط آبی را افزایش می‌دهد. وجود بیوسورفکتانت‌ها همچنین بر نای تأثیر می‌گذارد، که طول آن نزدیک به سطح است و خزیدن لاروها به سطح و تنفس را آسان‌تر می‌کند. در نتیجه، کشش سطحی آب کاهش می‌یابد. از آنجایی که لاروها نمی‌توانند به سطح آب بچسبند، به کف مخزن می‌افتند و فشار هیدرواستاتیک را مختل می‌کنند و در نتیجه باعث مصرف بیش از حد انرژی و مرگ در اثر غرق شدن می‌شوند. نتایج مشابهی توسط Ghribi61 به دست آمد، جایی که یک بیوسورفکتانت تولید شده توسط Bacillus subtilis فعالیت لاروکشی علیه Ephestia kuehniella نشان داد. به طور مشابه، فعالیت لاروکشی Cx. Das و Mukherjee23 نیز تأثیر لیپوپپتیدهای حلقوی را بر لاروهای quinquefasciatus ارزیابی کردند.
نتایج این مطالعه مربوط به فعالیت لاروکشی بیوسورفکتانت‌های رامنولیپیدی علیه Cx است. کشتن پشه‌های quinquefasciatus با نتایج منتشر شده قبلی سازگار است. به عنوان مثال، بیوسورفکتانت‌های مبتنی بر سورفکتانت تولید شده توسط باکتری‌های مختلف از جنس Bacillus و گونه‌های Pseudomonas استفاده می‌شوند. برخی گزارش‌های اولیه64،65،66 فعالیت لاروکشی بیوسورفکتانت‌های لیپوپپتیدی از Bacillus subtilis را گزارش کرده‌اند23. Deepali و همکاران. 63 دریافتند که بیوسورفکتانت رامنولیپید جدا شده از Stenotropomonas maltophilia در غلظت 10 میلی‌گرم در لیتر فعالیت لاروکشی قوی دارد. Silva و همکاران. 67 فعالیت لاروکشی بیوسورفکتانت رامنولیپید علیه Ae را در غلظت 1 گرم در لیتر گزارش کردند. Aedes aegypti. Kanakdande و همکاران. 68 گزارش دادند که بیوسورفکتانت‌های لیپوپپتیدی تولید شده توسط باسیلوس سوبتیلیس باعث مرگ و میر کلی در لاروها و موریانه‌های کولکس با بخش لیپوفیلیک اکالیپتوس می‌شوند. به طور مشابه، ماسندرا و همکاران. 69 مرگ و میر 61.7 درصدی مورچه‌های کارگر (Cryptotermes cynocephalus Light.) را در بخش‌های لیپوفیلیک n-هگزان و EtOAc عصاره خام E. گزارش کردند.
پارتیپان و همکارانش در سال 70، استفاده حشره‌کشی از بیوسورفکتانت‌های لیپوپپتیدی تولید شده توسط باسیلوس سوبتیلیس A1 و سودوموناس استوتزری NA3 را علیه آنوفل استفنسی، ناقل انگل مالاریا، پلاسمودیوم، گزارش کردند. آنها مشاهده کردند که لاروها و شفیره‌ها در صورت تیمار با غلظت‌های مختلف بیوسورفکتانت‌ها، مدت زمان بیشتری زنده می‌مانند، دوره تخم‌گذاری کوتاه‌تری دارند، عقیم هستند و طول عمر کوتاه‌تری دارند. مقادیر LC50 مشاهده شده برای بیوسورفکتانت A1 باسیلوس سوبتیلیس به ترتیب 3.58، 4.92، 5.37، 7.10 و 7.99 میلی‌گرم در لیتر برای حالت‌های مختلف لاروی (یعنی لارو I، II، III، IV و شفیره) بود. در مقایسه، بیوسورفکتانت‌ها برای مراحل لاروی I-IV و شفیره Pseudomonas stutzeri NA3 به ترتیب 2.61، 3.68، 4.48، 5.55 و 6.99 میلی‌گرم در لیتر بود. تصور می‌شود که تأخیر در فنولوژی لاروها و شفیره‌های زنده‌مانده، نتیجه‌ی اختلالات فیزیولوژیکی و متابولیکی قابل توجه ناشی از تیمارهای حشره‌کش باشد.71
سویه Wickerhamomyces anomalus CCMA 0358 بیوسورفکتانتی با فعالیت لاروکشی 100٪ علیه پشه‌های Aedes تولید می‌کند. aegypti در فاصله 24 ساعته 38 بیشتر از گزارش سیلوا و همکارانش بود. نشان داده شده است که بیوسورفکتانت تولید شده از Pseudomonas aeruginosa با استفاده از روغن آفتابگردان به عنوان منبع کربن، 100٪ لاروها را در عرض 48 ساعت از بین می‌برد. Abinaya و همکارانش72 و Pradhan و همکارانش73 همچنین اثرات لاروکشی یا حشره‌کشی سورفکتانت‌های تولید شده توسط چندین جدایه از جنس Bacillus را نشان دادند. یک مطالعه که قبلاً توسط Senthil-Nathan و همکارانش منتشر شده بود، نشان داد که 100٪ لاروهای پشه که در معرض تالاب‌های گیاهی قرار می‌گیرند، احتمالاً می‌میرند.74.
ارزیابی اثرات زیرکشنده حشره‌کش‌ها بر زیست‌شناسی حشرات برای برنامه‌های مدیریت تلفیقی آفات بسیار مهم است زیرا دوزها/غلظت‌های زیرکشنده حشرات را نمی‌کشند، اما ممکن است با ایجاد اختلال در ویژگی‌های بیولوژیکی، جمعیت حشرات را در نسل‌های آینده کاهش دهند10. سیکیرا و همکارانش 75 فعالیت لاروکشی کامل (مرگ و میر 100٪) بیوسورفکتانت رامنولیپید (300 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) را هنگام آزمایش در غلظت‌های مختلف از 50 تا 300 میلی‌گرم در میلی‌لیتر مشاهده کردند. مرحله لاروی سویه‌های Aedes aegypti. آنها اثرات زمان مرگ و غلظت‌های زیرکشنده را بر بقای لارو و فعالیت شنا تجزیه و تحلیل کردند. علاوه بر این، آنها کاهش سرعت شنا را پس از 24 تا 48 ساعت قرار گرفتن در معرض غلظت‌های زیرکشنده بیوسورفکتانت (به عنوان مثال، 50 میلی‌گرم در میلی‌لیتر و 100 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) مشاهده کردند. تصور می‌شود سمومی که نقش‌های زیرکشنده امیدوارکننده‌ای دارند، در ایجاد آسیب‌های متعدد به آفات در معرض خطر مؤثرتر باشند76.
مشاهدات بافت‌شناسی نتایج ما نشان می‌دهد که بیوسورفکتانت‌های تولید شده توسط Enterobacter cloacae SJ2 به طور قابل توجهی بافت‌های لارو پشه (Cx. quinquefasciatus) و موریانه (O. obesus) را تغییر می‌دهند. ناهنجاری‌های مشابهی توسط آماده‌سازی روغن ریحان در An. gambiae.s و An. arabica ایجاد شد که توسط Ochola77 شرح داده شده است. Kamaraj و همکاران.78 نیز همین ناهنجاری‌های مورفولوژیکی را در An. Stephanie توصیف کردند. لاروها در معرض نانوذرات طلا قرار گرفتند. Vasantha-Srinivasan و همکاران.79 همچنین گزارش دادند که اسانس کیسه چوپان به شدت به محفظه و لایه‌های اپیتلیال Aedes albopictus آسیب رساند. Aedes aegypti. Raghavendran و همکاران گزارش دادند که لاروهای پشه با عصاره میسلیومی 500 میلی‌گرم در میلی‌لیتر از یک قارچ Penicillium محلی درمان شدند. Ae آسیب بافتی شدیدی نشان می‌دهد. aegypti و Cx. میزان مرگ و میر 80. پیش از این، Abinaya و همکاران. لاروهای سن چهارم An مورد مطالعه قرار گرفتند. Stephensi و Ae. aegypti تغییرات بافت‌شناسی متعددی را در Aedes aegypti تحت درمان با اگزوپلی‌ساکاریدهای B. licheniformis، از جمله سکوم معده، آتروفی عضلانی، آسیب و بی‌نظمی گانگلیون‌های طناب عصبی، مشاهده کردند.72. طبق گفته Raghavendran و همکاران، پس از درمان با عصاره میسلیومی P. daleae، سلول‌های روده میانی پشه‌های مورد آزمایش (لاروهای سن چهارم) تورم لومن روده، کاهش محتوای بین سلولی و دژنراسیون هسته‌ای را نشان دادند.81. همین تغییرات بافت‌شناسی در لاروهای پشه تحت درمان با عصاره برگ اکیناسه مشاهده شد که نشان‌دهنده پتانسیل حشره‌کشی ترکیبات تحت درمان است.50
استفاده از نرم‌افزار ECOSAR به رسمیت شناخته شده بین‌المللی82 شده است. تحقیقات فعلی نشان می‌دهد که سمیت حاد بیوسورفکتانت‌های ECOSAR برای ریزجلبک‌ها (C. vulgaris)، ماهی‌ها و کک‌های آبی (D. magna) در دسته «سمیت» تعریف شده توسط سازمان ملل متحد83 قرار می‌گیرد. مدل سمیت اکولوژیکی ECOSAR از SAR و QSAR برای پیش‌بینی سمیت حاد و طولانی‌مدت مواد استفاده می‌کند و اغلب برای پیش‌بینی سمیت آلاینده‌های آلی82،84 استفاده می‌شود.
پارافرمالدهید، بافر فسفات سدیم (pH 7.4) و سایر مواد شیمیایی مورد استفاده در این مطالعه از آزمایشگاه‌های HiMedia هند خریداری شدند.
تولید بیوسورفکتانت در ارلن‌های 500 میلی‌لیتری حاوی 200 میلی‌لیتر محیط کشت استریل بوشنل هاس غنی‌شده با 1٪ نفت خام به عنوان تنها منبع کربن انجام شد. پیش‌کشت انتروباکتر کلوآکه SJ2 (1.4 × 104 CFU/ml) تلقیح و به مدت 7 روز روی شیکر مداری در دمای 37 درجه سانتیگراد، با سرعت 200 دور در دقیقه کشت داده شد. پس از دوره انکوباسیون، بیوسورفکتانت با سانتریفیوژ کردن محیط کشت با سرعت 3400×g به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد استخراج شد و محلول رویی حاصل برای اهداف غربالگری استفاده شد. روش‌های بهینه‌سازی و توصیف بیوسورفکتانت‌ها از مطالعه قبلی ما 26 اقتباس شده است.
لاروهای Culex quinquefasciatus از مرکز مطالعات پیشرفته زیست‌شناسی دریایی (CAS)، پالانچی‌پتای، تامیل نادو (هند) تهیه شدند. لاروها در ظروف پلاستیکی پر از آب دیونیزه در دمای 27 ± 2 درجه سانتیگراد و دوره نوری 12:12 (روشنایی:تاریکی) پرورش داده شدند. لاروهای پشه با محلول گلوکز 10٪ تغذیه شدند.
لاروهای کولکس کوینکوفاسیاتوس در مخازن سپتیک باز و بدون محافظ یافت شده‌اند. از دستورالعمل‌های طبقه‌بندی استاندارد برای شناسایی و کشت لارو در آزمایشگاه استفاده کنید85. آزمایش‌های لاروکشی مطابق با توصیه‌های سازمان بهداشت جهانی انجام شد86. SH. لاروهای سن چهارم کوینکوفاسیاتوس در لوله‌های دربسته در گروه‌های 25 میلی‌لیتری و 50 میلی‌لیتری با فاصله هوایی دو سوم ظرفیت آنها جمع‌آوری شدند. بیوسورفکتانت (0-50 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) به صورت جداگانه به هر لوله اضافه و در دمای 25 درجه سانتیگراد نگهداری شد. لوله کنترل فقط از آب مقطر (50 میلی‌لیتر) استفاده کرد. لاروهای مرده آنهایی در نظر گرفته شدند که در طول دوره انکوباسیون (12-48 ساعت) هیچ نشانه‌ای از شنا نشان ندادند87. درصد مرگ و میر لاروها را با استفاده از معادله محاسبه کنید. (1)88.
خانواده Odontotermitidae شامل موریانه هندی Odontotermes obesus است که در کنده‌های پوسیده در پردیس کشاورزی (دانشگاه آنامالای، هند) یافت می‌شود. این بیوسورفکتانت (0 تا 50 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) را با استفاده از روش‌های معمول آزمایش کنید تا مشخص شود که آیا مضر است یا خیر. پس از خشک شدن در جریان هوای آرام به مدت 30 دقیقه، هر نوار کاغذ واتمن با بیوسورفکتانت با غلظت 30، 40 یا 50 میلی‌گرم در میلی‌لیتر پوشش داده شد. نوارهای کاغذ از پیش پوشش داده شده و بدون پوشش در مرکز یک پتری دیش آزمایش و مقایسه شدند. هر پتری دیش حاوی حدود سی موریانه فعال O. obesus است. به موریانه‌های کنترل و آزمایش، کاغذ مرطوب به عنوان منبع غذایی داده شد. همه پلیت‌ها در طول دوره انکوباسیون در دمای اتاق نگهداری شدند. موریانه‌ها پس از 12، 24، 36 و 48 ساعت مردند89،90. سپس از معادله 1 برای تخمین درصد مرگ و میر موریانه‌ها در غلظت‌های مختلف بیوسورفکتانت استفاده شد. (2).
نمونه‌ها روی یخ نگهداری و در میکروتیوب‌های حاوی ۱۰۰ میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم ۰.۱ مولار (pH 7.4) بسته‌بندی و برای تجزیه و تحلیل بیشتر به آزمایشگاه آسیب‌شناسی آبزی‌پروری مرکزی (CAPL) مرکز آبزی‌پروری راجیو گاندی (RGCA) ارسال شدند. آزمایشگاه بافت‌شناسی، سیرکالی، ناحیه مائیلادوثورای، تامیل نادو، هند. نمونه‌ها بلافاصله در پارافرمالدهید ۴٪ در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸ ساعت تثبیت شدند.
پس از مرحله تثبیت، ماده سه بار با بافر فسفات سدیم 0.1 مولار (pH 7.4) شسته شد، به صورت مرحله‌ای در اتانول دهیدراته شد و به مدت 7 روز در رزین LEICA خیسانده شد. سپس ماده در یک قالب پلاستیکی پر از رزین و پلیمرایزر قرار داده می‌شود و سپس در فر با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار می‌گیرد تا بلوک حاوی ماده به طور کامل پلیمریزه شود.
پس از پلیمریزاسیون، بلوک‌ها با استفاده از میکروتوم LEICA RM2235 (Rankin Biomedical Corporation 10,399 Enterprise Dr. Davisburg, MI 48,350, USA) به ضخامت 3 میلی‌متر برش داده شدند. برش‌ها روی اسلایدها گروه‌بندی شدند و در هر اسلاید شش بخش قرار گرفت. اسلایدها در دمای اتاق خشک شدند، سپس به مدت 7 دقیقه با هماتوکسیلین رنگ‌آمیزی و به مدت 4 دقیقه با آب جاری شسته شدند. علاوه بر این، محلول ائوزین را به مدت 5 دقیقه روی پوست بمالید و به مدت 5 دقیقه با آب جاری بشویید.
سمیت حاد با استفاده از موجودات آبزی از سطوح مختلف گرمسیری پیش‌بینی شد: LC50 ماهی ۹۶ ساعته، LC50 D. magna ۴۸ ساعته و EC50 جلبک سبز ۹۶ ساعته. سمیت بیوسورفکتانت‌های رامنولیپید برای ماهی و جلبک سبز با استفاده از نرم‌افزار ECOSAR نسخه ۲.۲ برای ویندوز که توسط آژانس حفاظت از محیط زیست ایالات متحده توسعه داده شده است، ارزیابی شد. (به صورت آنلاین در https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model موجود است).
تمام آزمایش‌ها برای فعالیت لاروکشی و ضد موریانه در سه تکرار انجام شد. رگرسیون غیرخطی (لگاریتم متغیرهای پاسخ به دوز) از داده‌های مرگ و میر لارو و موریانه برای محاسبه غلظت کشنده متوسط ​​(LC50) با فاصله اطمینان 95٪ انجام شد و منحنی‌های پاسخ به غلظت با استفاده از Prism® (نسخه 8.0، GraphPad Software) Inc.، ایالات متحده آمریکا) 84، 91 تولید شدند.
مطالعه حاضر پتانسیل بیوسورفکتانت‌های میکروبی تولید شده توسط Enterobacter cloacae SJ2 را به عنوان عوامل لاروکش و ضد موریانه پشه نشان می‌دهد و این کار به درک بهتر مکانیسم‌های عمل لاروکش و ضد موریانه کمک خواهد کرد. مطالعات بافت‌شناسی لاروهای تیمار شده با بیوسورفکتانت‌ها، آسیب به دستگاه گوارش، روده میانی، قشر مغز و هیپرپلازی سلول‌های اپیتلیال روده را نشان داد. نتایج: ارزیابی سم‌شناسی فعالیت ضد موریانه و لاروکش بیوسورفکتانت رامنولیپید تولید شده توسط Enterobacter cloacae SJ2 نشان داد که این جدایه یک آفت‌کش زیستی بالقوه برای کنترل بیماری‌های منتقله از طریق ناقلین پشه‌ها (Cx quinquefasciatus) و موریانه‌ها (O. obesus) است. نیاز به درک سمیت محیطی اساسی بیوسورفکتانت‌ها و اثرات بالقوه زیست‌محیطی آنها وجود دارد. این مطالعه مبنای علمی برای ارزیابی خطر زیست‌محیطی بیوسورفکتانت‌ها فراهم می‌کند.