مرگ و میر و سمیت فرآورده‌های تجاری سیپرمترین برای بچه قورباغه‌های کوچک آبزی

این مطالعه میزان کشندگی، زیرکشندگی و سمیت داروهای تجاری را ارزیابی کرد.سیپرمترینفرمولاسیون‌ها برای بچه قورباغه‌های بی‌دندان. در آزمایش حاد، غلظت‌های ۱۰۰ تا ۸۰۰ میکروگرم در لیتر به مدت ۹۶ ساعت آزمایش شدند. در آزمایش مزمن، غلظت‌های طبیعی سایپرمترین (۱، ۳، ۶ و ۲۰ میکروگرم در لیتر) برای بررسی مرگ و میر آزمایش شدند و پس از آن آزمایش میکرونوکلئوس و ناهنجاری‌های هسته‌ای گلبول‌های قرمز به مدت ۷ روز انجام شد. LC50 فرمولاسیون تجاری سایپرمترین برای بچه قورباغه‌ها ۲۷۳.۴۱ میکروگرم در لیتر بود. در آزمایش مزمن، بالاترین غلظت (۲۰ میکروگرم در لیتر) منجر به مرگ و میر بیش از ۵۰٪ شد، زیرا نیمی از بچه قورباغه‌های آزمایش شده را کشت. آزمایش میکرونوکلئوس نتایج قابل توجهی در ۶ و ۲۰ میکروگرم در لیتر نشان داد و چندین ناهنجاری هسته‌ای شناسایی شد که نشان می‌دهد فرمولاسیون تجاری سایپرمترین پتانسیل ژنوتوکسیک علیه P. gracilis دارد. سایپرمترین برای این گونه خطر بالایی دارد که نشان می‌دهد می‌تواند مشکلات متعددی ایجاد کند و پویایی این اکوسیستم را در کوتاه‌مدت و بلندمدت تحت تأثیر قرار دهد. بنابراین، می‌توان نتیجه گرفت که فرمولاسیون‌های تجاری سایپرمترین اثرات سمی بر P. gracilis دارند.
با توجه به گسترش مداوم فعالیت‌های کشاورزی و کاربرد فشرده ...کنترل آفاتبا توجه به اقدامات پیشگیرانه، حیوانات آبزی اغلب در معرض آفت‌کش‌ها قرار می‌گیرند1،2. آلودگی منابع آب در نزدیکی مزارع کشاورزی می‌تواند بر رشد و بقای موجودات غیرهدف مانند دوزیستان تأثیر بگذارد.
دوزیستان به طور فزاینده‌ای در ارزیابی ماتریس‌های محیطی اهمیت پیدا می‌کنند. قورباغه‌های آبی به دلیل ویژگی‌های منحصر به فرد خود مانند چرخه‌های زندگی پیچیده، نرخ رشد سریع لارو، وضعیت تغذیه‌ای، پوست نفوذپذیر10،11، وابستگی به آب برای تولید مثل12 و تخم‌های بدون محافظ11،13،14، به عنوان شاخص‌های زیستی خوبی برای آلاینده‌های محیطی در نظر گرفته می‌شوند. قورباغه آبی کوچک (Physalaemus gracilis)، که معمولاً به عنوان قورباغه گریان شناخته می‌شود، به عنوان یک گونه شاخص زیستی آلودگی آفت‌کش‌ها4،5،6،7،15 شناخته شده است. این گونه در آب‌های راکد، مناطق حفاظت شده یا مناطقی با زیستگاه متغیر در آرژانتین، اروگوئه، پاراگوئه و برزیل16 یافت می‌شود و به دلیل پراکندگی گسترده و تحمل زیستگاه‌های مختلف، توسط طبقه‌بندی IUCN پایدار در نظر گرفته می‌شود18.
اثرات زیرکشنده در دوزیستان پس از قرار گرفتن در معرض سایپرمترین گزارش شده است، از جمله تغییرات رفتاری، مورفولوژیکی و بیوشیمیایی در بچه قورباغه‌ها23،24،25، تغییر در مرگ و میر و زمان دگردیسی، تغییرات آنزیمی، کاهش موفقیت در تخم‌ریزی24،25، بیش‌فعالی26، مهار فعالیت کولین استراز27 و تغییرات در عملکرد شنا7،28. با این حال، مطالعات مربوط به اثرات ژنوتوکسیک سایپرمترین در دوزیستان محدود است. بنابراین، ارزیابی حساسیت گونه‌های آنوران به سایپرمترین مهم است.
آلودگی محیط زیست بر رشد و نمو طبیعی دوزیستان تأثیر می‌گذارد، اما جدی‌ترین اثر نامطلوب آن آسیب ژنتیکی به DNA ناشی از قرار گرفتن در معرض آفت‌کش‌ها است13. تجزیه و تحلیل مورفولوژی سلول‌های خون یک شاخص زیستی مهم برای آلودگی و سمیت بالقوه یک ماده برای گونه‌های وحشی است29. آزمایش میکرونوکلئوس یکی از رایج‌ترین روش‌های مورد استفاده برای تعیین سمیت ژنتیکی مواد شیمیایی در محیط است30. این یک روش سریع، مؤثر و ارزان است که شاخص خوبی برای آلودگی شیمیایی موجوداتی مانند دوزیستان است31،32 و می‌تواند اطلاعاتی در مورد قرار گرفتن در معرض آلاینده‌های ژنوتوکسیک ارائه دهد33.
هدف از این مطالعه ارزیابی پتانسیل سمی فرمولاسیون‌های تجاری سایپرمترین برای بچه قورباغه‌های کوچک آبزی با استفاده از آزمایش میکرونوکلئوس و ارزیابی ریسک اکولوژیکی بود.
میزان مرگ و میر تجمعی (%) بچه قورباغه‌های P. gracilis که در طول دوره حاد آزمایش در معرض غلظت‌های مختلف سایپرمترین تجاری قرار گرفته‌اند.
میزان مرگ و میر تجمعی (%) بچه قورباغه‌های P. gracilis که در معرض غلظت‌های مختلف سایپرمترین تجاری در طول یک آزمایش مزمن قرار گرفته‌اند.
مرگ و میر بالای مشاهده شده، نتیجه اثرات ژنوتوکسیک در دوزیستان در معرض غلظت‌های مختلف سایپرمترین (6 و 20 میکروگرم در لیتر) بود، همانطور که با وجود ریزهسته‌ها (MN) و ناهنجاری‌های هسته‌ای در گلبول‌های قرمز نشان داده شده است. تشکیل MN نشان دهنده خطاهایی در میتوز است و با اتصال ضعیف کروموزوم‌ها به میکروتوبول‌ها، نقص در کمپلکس‌های پروتئینی مسئول جذب و انتقال کروموزوم، خطا در جداسازی کروموزوم‌ها و خطا در ترمیم آسیب DNA مرتبط است38،39 و ممکن است با استرس اکسیداتیو ناشی از آفت‌کش‌ها مرتبط باشد40،41. سایر ناهنجاری‌ها در تمام غلظت‌های مورد ارزیابی مشاهده شد. افزایش غلظت سایپرمترین، ناهنجاری‌های هسته‌ای در گلبول‌های قرمز را به ترتیب 5٪ و 20٪ در کمترین (1 میکروگرم در لیتر) و بیشترین (20 میکروگرم در لیتر) افزایش داد. به عنوان مثال، تغییرات در DNA یک گونه می‌تواند عواقب جدی برای بقای کوتاه مدت و بلندمدت داشته باشد که منجر به کاهش جمعیت، تغییر در تناسب تولید مثلی، همخونی، از دست دادن تنوع ژنتیکی و تغییر در نرخ مهاجرت می‌شود. همه این عوامل می‌توانند بر بقا و بقای گونه‌ها تأثیر بگذارند42،43. تشکیل ناهنجاری‌های اریتروئیدی ممکن است نشان‌دهنده انسداد در سیتوکینز باشد که منجر به تقسیم سلولی غیرطبیعی (اریتروسیت‌های دو هسته‌ای)44،45 می‌شود؛ هسته‌های چند لوبی، برآمدگی‌هایی از غشای هسته‌ای با لوب‌های متعدد هستند46، در حالی که سایر ناهنجاری‌های اریتروئیدی ممکن است با تکثیر DNA مرتبط باشند، مانند کلیه‌ها/برآمدگی‌های هسته‌ای47. وجود اریتروسیت‌های بدون هسته ممکن است نشان‌دهنده اختلال در انتقال اکسیژن، به ویژه در آب آلوده48،49 باشد. آپوپتوز نشان‌دهنده مرگ سلولی50 است.
مطالعات دیگر نیز اثرات ژنوتوکسیک سایپرمترین را نشان داده‌اند. کابانا و همکارانش51 وجود ریزهستک‌ها و تغییرات هسته‌ای مانند سلول‌های دو هسته‌ای و سلول‌های آپوپتوز را در سلول‌های Odontophrynus americanus پس از قرار گرفتن در معرض غلظت‌های بالای سایپرمترین (5000 و 10000 میکروگرم در لیتر) به مدت 96 ساعت نشان دادند. آپوپتوز ناشی از سایپرمترین همچنین در P. biligonigerus52 و Rhinella arenarum53 مشاهده شد. این نتایج نشان می‌دهد که سایپرمترین اثرات ژنوتوکسیک بر طیف وسیعی از موجودات آبزی دارد و سنجش MN و ENA ممکن است شاخصی از اثرات زیرکشنده بر دوزیستان باشد و ممکن است برای گونه‌های بومی و جمعیت‌های وحشی در معرض سموم قابل استفاده باشد12.
فرمولاسیون‌های تجاری سایپرمترین خطر زیست‌محیطی بالایی (حاد و مزمن) دارند، به طوری که غلظت‌های HQ آنها از سطح تعیین‌شده توسط آژانس حفاظت از محیط زیست ایالات متحده (EPA) فراتر رفته است54 که در صورت وجود در محیط، ممکن است بر گونه‌ها تأثیر منفی بگذارد. در ارزیابی خطر مزمن، NOEC برای مرگ و میر 3 میکروگرم در لیتر بود که تأیید می‌کند غلظت‌های موجود در آب ممکن است برای گونه‌ها خطرناک باشد55. NOEC کشنده برای لاروهای R. arenarum که در معرض مخلوطی از اندوسولفان و سایپرمترین قرار گرفتند، پس از 168 ساعت 500 میکروگرم در لیتر بود. این مقدار پس از 336 ساعت به 0.0005 میکروگرم در لیتر کاهش یافت. نویسندگان نشان می‌دهند که هرچه مدت زمان قرار گرفتن در معرض این ماده بیشتر باشد، غلظت‌های مضر برای گونه‌ها کمتر می‌شود. همچنین لازم به ذکر است که مقادیر NOEC در همان زمان قرار گرفتن در معرض، بالاتر از مقادیر P. gracilis بود که نشان می‌دهد پاسخ گونه به سایپرمترین مختص گونه است. علاوه بر این، از نظر مرگ و میر، مقدار CHQ برای P. gracilis پس از قرار گرفتن در معرض سایپرمترین به 64.67 رسید که بالاتر از مقدار مرجع تعیین شده توسط آژانس حفاظت از محیط زیست ایالات متحده54 است و مقدار CHQ برای لارو R. arenarum نیز بالاتر از این مقدار بود (CHQ > 388.00 پس از 336 ساعت)، که نشان می‌دهد حشره‌کش‌های مورد مطالعه خطر بالایی برای چندین گونه دوزیستان دارند. با توجه به اینکه P. gracilis تقریباً به 30 روز برای تکمیل دگردیسی نیاز دارد56، می‌توان نتیجه گرفت که غلظت‌های مورد مطالعه سایپرمترین ممکن است با جلوگیری از ورود افراد آلوده به مرحله بلوغ یا تولید مثل در سنین پایین، در کاهش جمعیت نقش داشته باشند.
در ارزیابی ریسک محاسبه‌شده‌ی ریزهستک‌ها و سایر ناهنجاری‌های هسته‌ای گلبول‌های قرمز، مقادیر CHQ از 14.92 تا 97.00 متغیر بود که نشان می‌دهد سایپرمترین حتی در زیستگاه طبیعی خود نیز خطر ژنوتوکسیک بالقوه‌ای برای P. gracilis دارد. با در نظر گرفتن مرگ و میر، حداکثر غلظت ترکیبات زنوبیوتیک قابل تحمل برای P. gracilis، 4.24 میکروگرم در لیتر بود. با این حال، غلظت‌های کم تا 1 میکروگرم در لیتر نیز اثرات ژنوتوکسیک نشان دادند. این واقعیت ممکن است منجر به افزایش تعداد افراد غیرطبیعی57 شود و بر توسعه و تولید مثل گونه‌ها در زیستگاه‌های آنها تأثیر بگذارد و منجر به کاهش جمعیت دوزیستان شود.
فرمولاسیون‌های تجاری حشره‌کش سایپرمترین، سمیت حاد و مزمن بالایی را برای P. gracilis نشان دادند. میزان مرگ و میر بالاتری مشاهده شد، احتمالاً به دلیل اثرات سمی، همانطور که با وجود ریزهسته‌ها و ناهنجاری‌های هسته‌ای گلبول‌های قرمز، به ویژه هسته‌های دندانه‌دار، هسته‌های لوب‌دار و هسته‌های وزیکولی مشهود است. علاوه بر این، گونه‌های مورد مطالعه، خطرات زیست‌محیطی افزایش‌یافته‌ای را، چه حاد و چه مزمن، نشان دادند. این داده‌ها، همراه با مطالعات قبلی گروه تحقیقاتی ما، نشان داد که حتی فرمولاسیون‌های تجاری مختلف سایپرمترین همچنان باعث کاهش فعالیت‌های استیل کولین استراز (AChE) و بوتیریل کولین استراز (BChE) و استرس اکسیداتیو58 می‌شوند و منجر به تغییراتی در فعالیت شنا و ناهنجاری‌های دهانی59 در P. gracilis می‌شوند، که نشان می‌دهد فرمولاسیون‌های تجاری سایپرمترین سمیت کشنده و زیرکشنده بالایی برای این گونه دارند. هارتمن و همکاران. ۶۰ نشان داد که فرمولاسیون‌های تجاری سایپرمترین در مقایسه با نه آفت‌کش دیگر، بیشترین سمیت را برای P. gracilis و گونه دیگری از همان جنس (P. cuvieri) دارند. این نشان می‌دهد که غلظت‌های قانونی تأیید شده سایپرمترین برای حفاظت از محیط زیست ممکن است منجر به مرگ و میر بالا و کاهش جمعیت در درازمدت شود.
مطالعات بیشتری برای ارزیابی سمیت این آفت‌کش برای دوزیستان مورد نیاز است، زیرا غلظت‌های موجود در محیط ممکن است باعث مرگ و میر بالا شده و خطر بالقوه‌ای برای P. gracilis ایجاد کند. تحقیقات روی گونه‌های دوزیستان باید تشویق شود، زیرا داده‌های مربوط به این موجودات، به ویژه گونه‌های برزیلی، کمیاب است.
آزمایش سمیت مزمن به مدت ۱۶۸ ساعت (۷ روز) تحت شرایط ایستا ادامه یافت و غلظت‌های زیرکشنده عبارت بودند از: ۱، ۳، ۶ و ۲۰ میکروگرم ماده مؤثر در لیتر. در هر دو آزمایش، ۱۰ بچه قورباغه در هر گروه تیمار با شش تکرار، برای مجموع ۶۰ بچه قورباغه در هر غلظت، ارزیابی شدند. در همین حال، تیمار فقط آب به عنوان کنترل منفی عمل کرد. هر چیدمان آزمایش شامل یک ظرف شیشه‌ای استریل با ظرفیت ۵۰۰ میلی‌لیتر و چگالی ۱ بچه قورباغه در هر ۵۰ میلی‌لیتر محلول بود. فلاسک برای جلوگیری از تبخیر با فیلم پلی‌اتیلن پوشانده شد و به طور مداوم هوادهی شد.
آب برای تعیین غلظت آفت‌کش‌ها در زمان‌های 0، 96 و 168 ساعت مورد تجزیه شیمیایی قرار گرفت. طبق گفته سابین و همکاران. 68 و مارتینز و همکاران. 69، تجزیه و تحلیل‌ها در آزمایشگاه تجزیه آفت‌کش‌ها (LARP) دانشگاه فدرال سانتا ماریا با استفاده از کروماتوگرافی گازی متصل به طیف‌سنجی جرمی چهارقطبی سه‌گانه (مدل Varian 1200، پالو آلتو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. تعیین کمی آفت‌کش‌ها در آب به عنوان ماده تکمیلی نشان داده شده است (جدول SM1).
برای آزمایش میکرونوکلئوس (MNT) و آزمایش ناهنجاری هسته‌ای گلبول قرمز (RNA)، 15 بچه قورباغه از هر گروه درمانی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. بچه قورباغه‌ها با 5% لیدوکائین (50 میلی‌گرم در گرم - 170) بی‌هوش شدند و نمونه‌های خون با استفاده از سرنگ‌های هپارینه یکبار مصرف از طریق سوراخ کردن قلب جمع‌آوری شدند. گسترش‌های خون روی اسلایدهای میکروسکوپی استریل تهیه، در هوا خشک، به مدت 2 دقیقه با متانول 100% (4 درجه سانتیگراد) تثبیت و سپس به مدت 15 دقیقه در تاریکی با محلول 10% گیمسا رنگ‌آمیزی شدند. در پایان فرآیند، اسلایدها با آب مقطر شسته شدند تا رنگ اضافی از بین برود و در دمای اتاق خشک شدند.
حداقل 1000 گلبول قرمز از هر بچه قورباغه با استفاده از میکروسکوپ 100× با عدسی شیئی 71 برای تعیین وجود MN و ENA مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. در مجموع 75796 گلبول قرمز از بچه قورباغه‌ها با در نظر گرفتن غلظت‌های سایپرمترین و گروه کنترل ارزیابی شدند. سمیت ژنتیکی طبق روش Carrasco و همکاران و Fenech و همکاران38،72 با تعیین فراوانی ضایعات هسته‌ای زیر تجزیه و تحلیل شد: (1) سلول‌های بدون هسته: سلول‌های بدون هسته؛ (2) سلول‌های آپوپتوز: قطعه قطعه شدن هسته‌ای، مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی؛ (3) سلول‌های دو هسته‌ای: سلول‌هایی با دو هسته؛ (4) جوانه‌های هسته‌ای یا سلول‌های حبابی: سلول‌هایی با هسته‌هایی با برآمدگی‌های کوچک غشای هسته‌ای، حباب‌هایی با اندازه مشابه ریزهستک‌ها؛ (5) سلول‌های کاریولیز شده: سلول‌هایی با فقط طرح کلی هسته بدون مواد داخلی؛ (6) سلول‌های شکاف‌دار: سلول‌هایی با هسته‌هایی با ترک‌ها یا شکاف‌های واضح در شکل خود، که هسته‌های کلیوی شکل نیز نامیده می‌شوند؛ (7) سلول‌های لوبوله: سلول‌هایی با برآمدگی‌های هسته‌ای بزرگتر از وزیکول‌های فوق‌الذکر؛ و (8) ریزسلول‌ها: سلول‌هایی با هسته‌های متراکم و سیتوپلاسم کاهش‌یافته. تغییرات با نتایج کنترل منفی مقایسه شدند.
نتایج آزمایش سمیت حاد (LC50) با استفاده از نرم‌افزار GBasic و روش TSK-Trimmed Spearman-Karber74 تجزیه و تحلیل شدند. داده‌های آزمایش مزمن از نظر نرمال بودن خطا (Shapiro-Wilks) و همگنی واریانس (Bartlett) پیش‌آزمون شدند. نتایج با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) تجزیه و تحلیل شدند. از آزمون Tukey برای مقایسه داده‌ها بین خودشان و از آزمون Dunnett برای مقایسه داده‌ها بین گروه درمان و گروه کنترل منفی استفاده شد.
داده‌های LOEC و NOEC با استفاده از آزمون دانت تجزیه و تحلیل شدند. آزمون‌های آماری با استفاده از نرم‌افزار Statistica 8.0 (StatSoft) با سطح معنی‌داری 95٪ (0.05 > p) انجام شد.