مرگ و میر و سمیت آماده سازی سایپرمترین تجاری برای قورباغه های کوچک آبزی

این مطالعه کشندگی، کشندگی و سمیت تجاری را ارزیابی کردسیپرمترینفرمولاسیون برای قورباغه anuran. در آزمایش حاد، غلظت 100-800 میکروگرم در لیتر به مدت 96 ساعت مورد آزمایش قرار گرفت. در آزمایش مزمن، غلظت طبیعی سیپرمترین (1، 3، 6، و 20 میکروگرم در لیتر) برای مرگ و میر مورد آزمایش قرار گرفت، سپس آزمایش میکرونوکلئوس و ناهنجاری های هسته ای گلبول های قرمز خون به مدت 7 روز انجام شد. LC50 فرمول تجاری سایپرمترین به قورباغه ها 273.41 میکروگرم L-1 بود. در آزمایش مزمن، بالاترین غلظت (20 میکروگرم L-1) منجر به مرگ و میر بیش از 50٪ شد، زیرا نیمی از بچه قورباغه های آزمایش شده را کشت. آزمایش میکرونوکلئوس نتایج قابل توجهی را در 6 و 20 میکروگرم L-1 نشان داد و چندین ناهنجاری هسته‌ای شناسایی شد، که نشان می‌دهد فرمول تجاری سایپرمترین دارای پتانسیل ژنوتوکسیک در برابر P. gracilis است. سایپرمترین خطر بالایی برای این گونه است که نشان می دهد می تواند مشکلات متعددی ایجاد کند و پویایی این اکوسیستم را در کوتاه مدت و بلند مدت تحت تاثیر قرار دهد. بنابراین، می توان نتیجه گرفت که فرمولاسیون تجاری سایپرمترین دارای اثرات سمی بر P. gracilis است.
با توجه به گسترش مداوم فعالیت های کشاورزی و کاربرد فشرده ازکنترل آفاتبه همین دلیل، آبزیان اغلب در معرض آفت کش ها هستند. آلودگی منابع آبی نزدیک مزارع کشاورزی می تواند بر توسعه و بقای موجودات غیر هدف مانند دوزیستان تأثیر بگذارد.
دوزیستان در ارزیابی ماتریس های محیطی اهمیت فزاینده ای پیدا می کنند. آنوران ها به دلیل ویژگی های منحصر به فردشان مانند چرخه های زندگی پیچیده، نرخ رشد سریع لارو، وضعیت تغذیه ای، پوست نفوذپذیر10،11، وابستگی به آب برای تولیدمثل12 و تخم های محافظت نشده، شاخص های زیستی خوبی برای آلاینده های محیطی در نظر گرفته می شوند. قورباغه کوچک آبی (Physalaemus gracilis)، که معمولاً به عنوان قورباغه گریان شناخته می شود، نشان داده شده است که یک گونه زیستی شاخص آلودگی آفت کش ها است4،5،6،7،15. این گونه در آب های ایستاده، مناطق حفاظت شده یا مناطق با زیستگاه متغیر در آرژانتین، اروگوئه، پاراگوئه و برزیل یافت می شود.
اثرات کشنده ای در دوزیستان به دنبال قرار گرفتن در معرض سیپرمترین گزارش شده است، از جمله تغییرات رفتاری، مورفولوژیکی و بیوشیمیایی در قورباغه ها 23، 24، 25، تغییر مرگ و میر و زمان دگردیسی، تغییرات آنزیمی، کاهش موفقیت جوجه درآوری24،25، بیش فعالی26، مهار عملکرد 28 و 28 فعالیت آنزیم. با این حال، مطالعات اثرات ژنوتوکسیک سیپرمترین در دوزیستان محدود است. بنابراین، ارزیابی حساسیت گونه های آنوران به سیپرمترین مهم است.
آلودگی محیطی بر رشد و نمو طبیعی دوزیستان تأثیر می گذارد، اما جدی ترین اثر نامطلوب آسیب ژنتیکی به DNA ناشی از قرار گرفتن در معرض آفت کش ها است. تجزیه و تحلیل مورفولوژی سلول های خونی یک شاخص زیستی مهم آلودگی و سمیت بالقوه یک ماده برای گونه های وحشی است. آزمایش میکرونوکلئوس یکی از متداول‌ترین روش‌ها برای تعیین سمیت ژنتیکی مواد شیمیایی در محیط است. روشی سریع، مؤثر و ارزان است که نشانگر خوبی برای آلودگی شیمیایی موجوداتی مانند دوزیستان است 31،32 و می تواند اطلاعاتی در مورد مواجهه با آلاینده های ژنوتوکسیک ارائه دهد.
هدف از این مطالعه ارزیابی پتانسیل سمی فرمولاسیون تجاری سایپرمترین به قورباغه های کوچک آبزی با استفاده از آزمون میکرونوکلئوس و ارزیابی ریسک اکولوژیکی بود.
مرگ و میر تجمعی (%) قورباغه های P. gracilis در معرض غلظت های مختلف سیپرمترین تجاری در طول دوره حاد آزمایش.
مرگ و میر تجمعی (٪) قورباغه های P. gracilis در معرض غلظت های مختلف سیپرمترین تجاری در طول یک آزمایش مزمن.
مرگ و میر بالای مشاهده شده نتیجه اثرات ژنوتوکسیک در دوزیستانی بود که در معرض غلظت های مختلف سیپرمترین (6 و 20 میکروگرم در لیتر) قرار داشتند، همانطور که با حضور میکرونوکلئوس (MN) و ناهنجاری های هسته ای در گلبول های قرمز مشهود است. تشکیل MN نشان‌دهنده خطا در میتوز است و با اتصال ضعیف کروموزوم‌ها به میکروتوبول‌ها، نقص در کمپلکس‌های پروتئینی مسئول جذب و انتقال کروموزوم، خطا در جداسازی کروموزوم و خطا در ترمیم آسیب DNA مرتبط است و ممکن است با استرس اکسیداتیو ناشی از آفت‌کش‌ها مرتبط باشد. سایر ناهنجاری ها در تمام غلظت های ارزیابی شده مشاهده شد. افزایش غلظت سیپرمترین ناهنجاری های هسته ای در گلبول های قرمز را به ترتیب در کمترین (1 میکروگرم در لیتر) و بالاترین (20 میکروگرم در لیتر) به ترتیب 5 و 20 درصد افزایش داد. به عنوان مثال، تغییرات در DNA یک گونه می تواند عواقب جدی برای بقای کوتاه مدت و بلندمدت داشته باشد که منجر به کاهش جمعیت، تغییر تناسب تولید مثل، همخونی، از دست دادن تنوع ژنتیکی و تغییر نرخ مهاجرت می شود. همه این عوامل می توانند بر بقا و نگهداری گونه ها تأثیر بگذارند42،43. تشکیل ناهنجاری های اریتروییدی ممکن است نشان دهنده بلوک در سیتوکینز باشد که منجر به تقسیم سلولی غیر طبیعی (گلبول های قرمز دو هسته ای) می شود. هسته‌های چند لوبی برآمدگی‌های غشای هسته‌ای با لوب‌های متعدد هستند، در حالی که سایر ناهنجاری‌های اریتروییدی ممکن است با تکثیر DNA مرتبط باشند، مانند کلیه‌های هسته‌ای/بلب‌ها47. وجود اریتروسیت‌های هسته‌دار ممکن است نشان‌دهنده اختلال در انتقال اکسیژن، به‌ویژه در آب‌های آلوده باشد. آپوپتوز نشان دهنده مرگ سلولی50 است.
مطالعات دیگر نیز اثرات ژنوتوکسیک سیپرمترین را نشان داده اند. Kabaña و همکاران 51 وجود ریزهسته‌ها و تغییرات هسته‌ای مانند سلول‌های دو هسته‌ای و سلول‌های آپوپتوز را در سلول‌های Odontophrynus americanus پس از قرار گرفتن در معرض غلظت‌های بالای سیپرمترین (5000 و 10000 میکروگرم در لیتر) به مدت 96 ساعت نشان دادند. آپوپتوز ناشی از سیپرمترین در P. biligonigerus52 و Rhinella arenarum53 نیز مشاهده شد. این نتایج نشان می دهد که سایپرمترین دارای اثرات ژنوتوکسیک بر روی طیف وسیعی از موجودات آبزی است و سنجش MN و ENA ممکن است شاخصی از اثرات کشنده بر دوزیستان باشد و ممکن است برای گونه های بومی و جمعیت های وحشی در معرض سموم کاربرد داشته باشد.
فرمول‌های تجاری سایپرمترین خطرات زیست‌محیطی بالایی (هم حاد و هم مزمن) به همراه دارند، به طوری که HQ از سطح آژانس حفاظت از محیط‌زیست ایالات متحده (EPA) فراتر می‌رود که در صورت وجود در محیط، ممکن است بر گونه‌ها تأثیر منفی بگذارد. در ارزیابی خطر مزمن، NOEC برای مرگ و میر 3 میکروگرم در لیتر بود، که تأیید می‌کند که غلظت‌های موجود در آب ممکن است برای گونه‌ها خطر ایجاد کند. NOEC کشنده برای لارو R. arenarum در معرض مخلوطی از اندوسولفان و سیپرمترین پس از 168 ساعت 500 میکروگرم L-1 بود. این مقدار پس از 336 ساعت به 0.0005 میکروگرم در لیتر کاهش یافت. نویسندگان نشان می‌دهند که هر چه مدت طولانی‌تر قرار گرفتن در معرض آن باشد، غلظت‌هایی که برای گونه مضر هستند کمتر می‌شود. همچنین مهم است که تاکید شود که مقادیر NOEC بالاتر از P. gracilis در همان زمان قرار گرفتن در معرض بود، که نشان می‌دهد پاسخ گونه به سیپرمترین خاص گونه است. علاوه بر این، از نظر مرگ و میر، مقدار CHQ P. gracilis پس از قرار گرفتن در معرض سایپرمترین به 64.67 رسید که بالاتر از مقدار مرجع تعیین شده توسط آژانس حفاظت از محیط زیست ایالات متحده54 است، و مقدار CHQ لارو R. arenarum نیز بالاتر از این مقدار بود (CHQ0 > 38360 indicaticides). خطر بالایی برای چندین گونه دوزیست دارد. با توجه به اینکه P. gracilis تقریباً به 30 روز برای تکمیل دگردیسی نیاز دارد56، می توان نتیجه گرفت که غلظت های مورد مطالعه سایپرمترین ممکن است با جلوگیری از ورود افراد آلوده به مرحله بزرگسالی یا تولید مثل در سنین پایین، به کاهش جمعیت کمک کند.
در ارزیابی ریسک محاسبه‌شده میکرونوکلئوس‌ها و سایر ناهنجاری‌های هسته‌ای گلبول قرمز، مقادیر CHQ از 14.92 تا 97.00 متغیر بود که نشان می‌دهد سیپرمترین خطر ژنوتوکسیک بالقوه‌ای برای P. gracilis حتی در زیستگاه طبیعی آن دارد. با در نظر گرفتن مرگ و میر، حداکثر غلظت ترکیبات بیگانه بیگانه قابل تحمل به P. gracilis 4.24 میکروگرم L-1 بود. با این حال، غلظت کمتر از 1 میکروگرم در لیتر نیز اثرات ژنوتوکسیک را نشان داد. این واقعیت ممکن است منجر به افزایش تعداد افراد غیرطبیعی شود57 و بر رشد و تکثیر گونه ها در زیستگاه آنها تأثیر بگذارد و منجر به کاهش جمعیت دوزیستان شود.
فرمول های تجاری حشره کش سیپرمترین سمیت حاد و مزمن بالایی را برای P. gracilis نشان دادند. میزان مرگ و میر بالاتری مشاهده شد، احتمالاً به دلیل اثرات سمی، همانطور که با حضور میکرونوکلئوس ها و ناهنجاری های هسته ای گلبول قرمز، به ویژه هسته های دندانه دار، هسته های لوب دار و هسته های تاولی مشهود است. علاوه بر این، گونه های مورد مطالعه خطرات محیطی حاد و مزمن را افزایش دادند. این داده‌ها، همراه با مطالعات قبلی توسط گروه تحقیقاتی ما، نشان داد که حتی فرمول‌های تجاری مختلف سایپرمترین همچنان باعث کاهش فعالیت‌های استیل کولین استراز (AChE) و بوتیریل کولین استراز (BChE) و استرس اکسیداتیو می‌شود و منجر به تغییرات در فعالیت شنا و ناهنجاری‌های دهانی می‌شود. سمیت برای این گونه هارتمن و همکاران 60 دریافتند که فرمول‌های تجاری سایپرمترین در مقایسه با 9 آفت‌کش دیگر برای P. gracilis و گونه دیگری از همان جنس (P. cuvieri) سمی‌ترین سمیت را دارند. این نشان می دهد که غلظت های قانونی تایید شده سایپرمترین برای حفاظت از محیط زیست ممکن است منجر به مرگ و میر بالا و کاهش درازمدت جمعیت شود.
مطالعات بیشتری برای ارزیابی سمیت آفت کش برای دوزیستان مورد نیاز است، زیرا غلظت های موجود در محیط ممکن است باعث مرگ و میر بالا شود و خطر بالقوه ای برای P. gracilis ایجاد کند. تحقیقات در مورد گونه های دوزیستان باید تشویق شود، زیرا داده های مربوط به این موجودات، به ویژه در مورد گونه های برزیلی کمیاب است.
آزمایش سمیت مزمن به مدت 168 ساعت (7 روز) تحت شرایط استاتیک به طول انجامید و غلظت های کشنده عبارت بودند از: 1، 3، 6 و 20 میکروگرم ai L-1. در هر دو آزمایش، 10 قورباغه در هر گروه تیمار با 6 تکرار، در مجموع 60 قورباغه در هر غلظت مورد ارزیابی قرار گرفت. در همین حال، تیمار فقط آب به عنوان یک کنترل منفی عمل کرد. هر مجموعه آزمایشی شامل یک ظرف شیشه ای استریل با ظرفیت 500 میلی لیتر و تراکم 1 قورباغه در هر 50 میلی لیتر محلول بود. فلاسک با فیلم پلی اتیلن پوشانده شد تا از تبخیر جلوگیری شود و به طور مداوم هوادهی می شد.
آب برای تعیین غلظت آفت کش در 0، 96 و 168 ساعت مورد تجزیه و تحلیل شیمیایی قرار گرفت. به گفته سابین و همکاران. 68 و مارتینز و همکاران. 69، آنالیزها در آزمایشگاه آنالیز آفت کش ها (LARP) دانشگاه فدرال سانتا ماریا با استفاده از کروماتوگرافی گازی جفت شده به طیف سنجی جرمی سه قطبی (واریان مدل 1200، پالو آلتو، کالیفرنیا، ایالات متحده) انجام شد. تعیین کمی آفت کش ها در آب به عنوان مواد تکمیلی نشان داده شده است (جدول SM1).
برای تست میکرونوکلئوس (MNT) و تست ناهنجاری هسته ای گلبول قرمز (RNA)، 15 قورباغه از هر گروه درمانی مورد بررسی قرار گرفت. قورباغه ها با لیدوکائین 5 درصد (50 میلی گرم در گرم در 170) بیهوش شدند و نمونه خون با سوراخ قلبی با استفاده از سرنگ های هپارینه یکبار مصرف جمع آوری شد. اسمیر خون روی لام های میکروسکوپ استریل تهیه شد، در هوا خشک شد، با متانول 100 درصد (4 درجه سانتیگراد) به مدت 2 دقیقه ثابت شد و سپس با محلول 10 درصد گیمسا به مدت 15 دقیقه در تاریکی رنگ آمیزی شد. در پایان فرآیند، لام ها با آب مقطر شسته شدند تا لکه اضافی از بین برود و در دمای اتاق خشک شوند.
حداقل 1000 گلبول قرمز از هر قورباغه با استفاده از یک میکروسکوپ 100 × با هدف 71 برای تعیین حضور MN و ENA تجزیه و تحلیل شد. در مجموع 75796 گلبول قرمز از قورباغه با در نظر گرفتن غلظت سیپرمترین و کنترل مورد ارزیابی قرار گرفت. سمیت ژنتیکی با توجه به روش کاراسکو و همکاران آنالیز شد. و Fenech et al.38,72 با تعیین فراوانی ضایعات هسته ای زیر: (1) سلول های هسته ای: سلول های بدون هسته. (2) سلول های آپوپتوز: تکه تکه شدن هسته ای، مرگ برنامه ریزی شده سلولی. (3) سلول های دو هسته ای: سلول هایی با دو هسته. (4) جوانه های هسته ای یا سلول های بلب: سلول هایی با هسته با برآمدگی های کوچک غشای هسته ای، حباب هایی شبیه به ریزهسته ها. (5) سلول‌های کاریولیز شده: سلول‌هایی که فقط طرح اصلی هسته را بدون مواد داخلی دارند. (6) سلول های بریدگی: سلول هایی با هسته هایی با شکاف های آشکار یا بریدگی هایی در شکل خود، که هسته های کلیه شکل نیز نامیده می شوند. (7) سلول های لوبوله: سلول هایی با برآمدگی های هسته ای بزرگتر از وزیکول های فوق الذکر. و (8) میکروسل ها: سلول هایی با هسته های متراکم و سیتوپلاسم کاهش یافته. تغییرات با نتایج کنترل منفی مقایسه شد.
نتایج آزمون سمیت حاد (LC50) با استفاده از نرم افزار GBasic و روش TSK-Trimmed Spearman-Karber مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. داده های آزمون مزمن برای نرمال بودن خطا (شاپیرو-ویلکز) و همگنی واریانس (بارتلت) از قبل مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج با استفاده از تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. از آزمون توکی برای مقایسه داده ها بین خود و از آزمون دانت برای مقایسه داده ها بین گروه درمان و گروه کنترل منفی استفاده شد.
داده های LOEC و NOEC با استفاده از آزمون Dunnett تجزیه و تحلیل شدند. آزمون‌های آماری با استفاده از نرم‌افزار Statistica 8.0 (StatSoft) با سطح معنی‌داری 95 درصد (05/0p<) انجام شد.