بیوسنسور کمی جیبرلین نقش جیبرلین ها را در مشخصات میانگره در مریستم آپیکال ساقه نشان می دهد.

رشد مریستم آپیکال ساقه (SAM) برای معماری ساقه حیاتی است. هورمون های گیاهیجیبرلین ها(GAs) نقش کلیدی در هماهنگی رشد گیاه دارند، اما نقش آنها در SAM هنوز به خوبی شناخته نشده است. در اینجا، ما با مهندسی پروتئین DELLA برای سرکوب عملکرد تنظیمی ضروری آن در پاسخ رونویسی GA در حالی که تخریب آن پس از تشخیص GA حفظ می‌شود، یک حسگر زیستی نسبت سنجی سیگنال‌دهی GA ایجاد کردیم. ما نشان می‌دهیم که این حسگر زیستی مبتنی بر تخریب، تغییرات در سطوح GA و سنجش سلولی را در طول توسعه به دقت ثبت می‌کند. ما از این حسگر زیستی برای ترسیم فعالیت سیگنالینگ GA در SAM استفاده کردیم. ما نشان می‌دهیم که سیگنال‌های GA بالا عمدتاً در سلول‌های واقع بین پریموردیای اندام، که پیش‌ساز سلول‌های میانگره هستند، وجود دارد. با استفاده از رویکردهای افزایش و از دست دادن عملکرد، ما بیشتر نشان می‌دهیم که GA جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی را تنظیم می‌کند، سازمان‌دهی سلولی متعارف میانگره‌ها را ایجاد می‌کند، در نتیجه مشخصات میانگره را در SAM ارتقا می‌دهد.
مریستم آپیکال شاخساره (SAM) که در راس ساقه قرار دارد، حاوی طاقچه ای از سلول های بنیادی است که فعالیت آن اندام های جانبی و گره های بنیادی را به صورت مدولار و تکراری در طول زندگی گیاه ایجاد می کند. هر یک از این واحدهای تکرار شونده یا گره‌های گیاهی شامل میانگره‌ها و اندام‌های جانبی در گره‌ها و مریستم‌های زیر بغل در محورهای برگ می‌شوند. رشد و سازماندهی گره های گیاهی در طول توسعه تغییر می کند. در آرابیدوپسیس، رشد بین گرهی در مرحله رویشی سرکوب می شود و مریستم های زیر بغل در زیر بغل برگ های روزت خاموش می مانند. در طی انتقال به مرحله گل، SAM به مریستم گل آذین تبدیل می‌شود و میانگره‌های دراز و جوانه‌های زیر بغل، شاخه‌های شاخه‌ای در بغل برگ‌های کاکلین و بعداً گل‌های بدون برگ ایجاد می‌کند. اگرچه ما پیشرفت قابل توجهی در درک مکانیسم‌هایی داشته‌ایم که شروع برگ‌ها، گل‌ها و شاخه‌ها را کنترل می‌کنند، اما اطلاعات نسبتا کمی در مورد چگونگی ایجاد میانگره‌ها وجود دارد.
درک توزیع فضایی و زمانی GA به درک بهتر عملکرد این هورمون ها در بافت های مختلف و در مراحل مختلف رشد کمک می کند. تجسم تخریب همجوشی RGA-GFP بیان شده تحت عمل پروموتر خود اطلاعات مهمی را در مورد تنظیم سطح کل GA در ریشه ها ارائه می دهد. با این حال، بیان RGA در بافت‌ها متفاوت است و توسط GA18 تنظیم می‌شود. بنابراین، بیان متفاوت پروموتر RGA ممکن است منجر به الگوی فلورسانس مشاهده شده با RGA-GFP شود و بنابراین این روش کمی نیست. اخیراً، GA19،20 نشاندار شده با فلورسئین زیست فعال (Fl) تجمع GA در غدد درونی ریشه و تنظیم سطوح سلولی آن توسط انتقال GA را نشان داد. اخیراً، حسگر GA FRET nlsGPS1 نشان داد که سطوح GA با افزایش طول سلول در ریشه‌ها، رشته‌ها و هیپولپه‌های تیره‌رشد همبستگی دارد. با این حال، همانطور که دیدیم، غلظت GA تنها پارامتر کنترل کننده فعالیت سیگنالینگ GA نیست، زیرا به فرآیندهای سنجش پیچیده بستگی دارد. در اینجا، با تکیه بر درک خود از مسیرهای سیگنال دهی DELLA و GA، توسعه و توصیف یک حسگر زیستی نسبت سنجی مبتنی بر تخریب برای سیگنالینگ GA را گزارش می کنیم. برای توسعه این بیوسنسور کمی، ما از یک RGA حساس به GA جهش یافته استفاده کردیم که به یک پروتئین فلورسنت ادغام شد و در همه جا در بافت ها بیان شد، و همچنین یک پروتئین فلورسنت حساس به GA. ما نشان می‌دهیم که همجوشی‌های پروتئین RGA جهش‌یافته با سیگنال‌دهی GA درون‌زا هنگامی که در همه جا بیان می‌شوند، تداخل ندارند و این حسگر زیستی می‌تواند فعالیت سیگنال‌دهی ناشی از ورودی GA و پردازش سیگنال GA توسط دستگاه سنجش با وضوح مکانی-زمانی بالا را کمیت کند. ما از این حسگر زیستی برای نقشه‌برداری توزیع مکانی-زمانی فعالیت سیگنال‌دهی GA و تعیین کمیت چگونگی تنظیم رفتار سلولی در اپیدرم SAM استفاده کردیم. ما نشان می‌دهیم که GA جهت‌گیری صفحه تقسیم سلول‌های SAM واقع بین پریموردیای اندام را تنظیم می‌کند، در نتیجه سازمان سلولی متعارف بینگره را تعریف می‌کند.
در نهایت، ما پرسیدیم که آیا qmRGA می تواند تغییرات در سطوح GA درون زا را با استفاده از هیپولپه های در حال رشد گزارش کند یا خیر. ما قبلا نشان دادیم که نیترات با افزایش سنتز GA و به نوبه خود، تخریب DELLA34 رشد را تحریک می کند. بر این اساس، ما مشاهده کردیم که طول هیپوکوتیل در نهال‌های pUBQ10::qmRGA که تحت منبع نیترات فراوان (10 میلی‌مولار NO3-) رشد کرده‌اند، به‌طور قابل‌توجهی بیشتر از نهال‌هایی است که در شرایط کمبود نیترات رشد کرده‌اند (شکل تکمیلی 6a). مطابق با پاسخ رشد، سیگنال‌های GA در هیپولپه‌های نهال‌هایی که تحت شرایط NO3-10 میلی‌مولار رشد کرده‌اند، بیشتر از نهال‌هایی بود که در غیاب نیترات رشد کرده بودند (شکل تکمیلی 6b، c). بنابراین، qmRGA همچنین نظارت بر تغییرات در سیگنال دهی GA ناشی از تغییرات درون زا در غلظت GA را امکان پذیر می کند.
برای درک اینکه آیا فعالیت سیگنالینگ GA شناسایی شده توسط qmRGA به غلظت GA و ادراک GA بستگی دارد، همانطور که بر اساس طراحی حسگر انتظار می‌رود، بیان سه گیرنده GID1 را در بافت‌های رویشی و زایشی تحلیل کردیم. در نهال ها، خط گزارشگر GID1-GUS نشان داد که GID1a و c در لپه ها به شدت بیان می شوند (شکل 3a-c). علاوه بر این، هر سه گیرنده در برگها، پریموردیای ریشه جانبی، نوک ریشه (به جز کلاهک ریشه GID1b) و سیستم آوندی بیان شدند (شکل 3a-c). در گل آذین SAM، سیگنال های GUS را فقط برای GID1b و 1c شناسایی کردیم (شکل تکمیلی 7a-c). هیبریداسیون درجا این الگوهای بیان را تأیید کرد و بیشتر نشان داد که GID1c به طور یکنواخت در سطوح پایین در SAM بیان شد، در حالی که GID1b بیان بالاتری را در حاشیه SAM نشان داد (شکل تکمیلی 7d-l). همجوشی ترجمه‌ای pGID1b::2xmTQ2-GID1b همچنین طیف درجه‌بندی شده‌ای از بیان GID1b، از بیان کم یا بدون بیان در مرکز SAM تا بیان بالا در مرزهای اندام را نشان داد (شکل تکمیلی 7m). بنابراین، گیرنده های GID1 به طور یکنواخت در سراسر بافت ها و درون بافت ها توزیع نمی شوند. در آزمایش‌های بعدی، ما همچنین مشاهده کردیم که بیان بیش از حد GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) حساسیت qmRGA را در هیپولپه‌ها به کاربرد خارجی GA افزایش داد (شکل 3d، e). در مقابل، فلورسانس اندازه گیری شده توسط qd17mRGA در هیپوکوتیل نسبت به تیمار GA3 غیر حساس بود (شکل 3f، g). برای هر دو سنجش، نهال‌ها با غلظت‌های بالای GA (100 میکرومولار GA3) برای ارزیابی رفتار سریع حسگر، جایی که توانایی اتصال به گیرنده GID1 افزایش یافته یا از دست رفت، تیمار شدند. با هم، این نتایج تایید می‌کنند که بیوسنسور qmRGA یک عملکرد ترکیبی به عنوان حسگر GA و GA دارد، و نشان می‌دهد که بیان متفاوت گیرنده GID1 می‌تواند به طور قابل‌توجهی گسیل سنسور را تعدیل کند.
تا به امروز، توزیع سیگنال های GA در SAM نامشخص است. بنابراین، ما از گیاهان بیان‌کننده qmRGA و گزارشگر سلول‌های بنیادی pCLV3::mCherry-NLS35 برای محاسبه نقشه‌های کمی با وضوح بالا از فعالیت سیگنال‌دهی GA، با تمرکز بر لایه L1 (اپیدرم؛ شکل 4a, b، روش‌ها و روش‌های مکمل SAM را در نقش کلیدی L31 در رشد A31) محاسبه کردیم. در اینجا، بیان pCLV3::mCherry-NLS یک نقطه مرجع هندسی ثابت برای تجزیه و تحلیل توزیع مکانی-زمانی فعالیت سیگنال دهی GA ارائه کرد. اگرچه GA برای رشد اندام جانبی ضروری در نظر گرفته می‌شود، اما مشاهده کردیم که سیگنال‌های GA در پریموردیوم گلی (P) با شروع از مرحله P3 (شکل 4a, b) کم بود، در حالی که پریموردیوم‌های جوان P1 و P2 فعالیت متوسطی مشابه با فعالیت در ناحیه مرکزی داشتند (شکل 4a, b). فعالیت سیگنال دهی بالاتر GA در مرزهای اولیه اندام شناسایی شد که از P1/P2 (در کناره های مرز) شروع می شود و در P4 به اوج می رسد، و همچنین در تمام سلول های ناحیه محیطی واقع بین پریموردیا (شکل 4a, b و شکل تکمیلی 8a, b). این فعالیت سیگنال دهی بالاتر GA نه تنها در اپیدرم بلکه در لایه های L2 و L3 بالایی نیز مشاهده شد (شکل تکمیلی 8b). الگوی سیگنال‌های GA شناسایی‌شده در SAM با استفاده از qmRGA نیز در طول زمان بدون تغییر باقی ماند (شکل تکمیلی 8c-f، k). اگرچه سازه qd17mRGA به طور سیستماتیک در SAM گیاهان T3 از پنج خط مستقل که ما به طور دقیق مشخص کردیم، تنظیم شد، ما قادر به تجزیه و تحلیل الگوهای فلورسانس به دست آمده با ساختار pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP بودیم (شکل تکمیلی 8g-j, l). در این خط کنترل، تنها تغییرات جزئی در نسبت فلورسانس در SAM تشخیص داده شد، اما در مرکز SAM کاهش واضح و غیرمنتظره‌ای در VENUS مرتبط با TagBFP مشاهده کردیم. این تأیید می کند که الگوی سیگنال دهی مشاهده شده توسط qmRGA منعکس کننده تخریب وابسته به GA از mRGA-VENUS است، اما همچنین نشان می دهد که qmRGA ممکن است فعالیت سیگنالینگ GA را در مرکز مریستم بیش از حد تخمین بزند. به طور خلاصه، نتایج ما یک الگوی سیگنالینگ GA را نشان می دهد که در درجه اول توزیع اولیه را منعکس می کند. این توزیع ناحیه بین اولیه (IPR) به دلیل ایجاد تدریجی فعالیت سیگنالینگ GA بالا بین پریموردیوم در حال توسعه و ناحیه مرکزی است، در حالی که در همان زمان فعالیت سیگنالینگ GA در پریموردیوم کاهش می یابد (شکل 4c, d).
توزیع گیرنده های GID1b و GID1c (به بالا مراجعه کنید) نشان می دهد که بیان متفاوت گیرنده های GA به شکل دادن به الگوی فعالیت سیگنال دهی GA در SAM کمک می کند. ما تعجب کردیم که آیا تجمع دیفرانسیل GA ممکن است دخیل باشد. برای بررسی این امکان از سنسور nlsGPS1 GA FRET21 استفاده کردیم. افزایش فرکانس فعال‌سازی در SAM nlsGPS1 که با 10 میکرومولار GA4+7 به مدت 100 دقیقه تیمار شده بود شناسایی شد (تصویر تکمیلی 9a-e)، که نشان می‌دهد nlsGPS1 به تغییرات غلظت GA در SAM پاسخ می‌دهد، همانطور که در roots21 انجام می‌دهد. توزیع فضایی فرکانس فعال‌سازی nlsGPS1 سطوح نسبتاً پایین GA را در لایه‌های بیرونی SAM نشان داد، اما نشان داد که آنها در مرکز و در مرزهای SAM بالا هستند (شکل 4e و شکل تکمیلی 9a,c). این نشان می دهد که GA نیز در SAM با یک الگوی فضایی قابل مقایسه با آنچه که توسط qmRGA نشان داده شده است، توزیع شده است. به عنوان یک رویکرد مکمل، ما همچنین SAM را با GA فلورسنت (GA3-، GA4-، GA7-Fl) یا Fl به تنهایی به عنوان یک کنترل منفی درمان کردیم. سیگنال Fl در سراسر SAM، از جمله ناحیه مرکزی و پریموردیوم، البته با شدت کمتر توزیع شد (شکل 4j و شکل تکمیلی 10d). در مقابل، هر سه GA-Fl به طور خاص در مرزهای اولیه و به درجات مختلف در بقیه IPR انباشته شدند، با GA7-Fl در بزرگترین دامنه در IPR (شکل 4k و شکل تکمیلی 10a,b). کمی کردن شدت فلورسانس نشان داد که نسبت IPR به شدت غیر IPR در SAM تیمار شده با GA-Fl در مقایسه با SAM تیمار شده با Fl بیشتر بود (شکل 4l و شکل تکمیلی 10c). با هم، این نتایج نشان می‌دهد که GA در غلظت‌های بالاتر در سلول‌های IPR که نزدیک‌ترین نقطه به مرز اندام قرار دارند، وجود دارد. این نشان می‌دهد که الگوی فعالیت سیگنال‌دهی SAM GA هم از بیان متفاوت گیرنده‌های GA و هم از تجمع افتراقی GA در سلول‌های IPR در نزدیکی مرزهای اندام ناشی می‌شود. بنابراین، تجزیه و تحلیل ما یک الگوی مکانی-زمانی غیرمنتظره از سیگنال دهی GA را با فعالیت کمتر در مرکز و ابتدایی SAM و فعالیت بالاتر در IPR در ناحیه محیطی نشان داد.
برای درک نقش فعالیت سیگنال دهی دیفرانسیل GA در SAM، ما همبستگی بین فعالیت سیگنالینگ GA، گسترش سلول، و تقسیم سلولی را با استفاده از تصویربرداری با گذشت زمان واقعی از SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS تجزیه و تحلیل کردیم. با توجه به نقش GA در تنظیم رشد، یک همبستگی مثبت با پارامترهای گسترش سلولی انتظار می رفت. بنابراین، ما ابتدا نقشه‌های فعالیت سیگنال‌دهی GA را با نقشه‌های سرعت رشد سطح سلولی (به عنوان نماینده قدرت انبساط سلولی برای یک سلول معین و برای سلول‌های دختر در هنگام تقسیم) و با نقشه‌های ناهمسانگردی رشد مقایسه کردیم، که جهت انبساط سلولی را اندازه‌گیری می‌کند (همچنین در اینجا برای یک سلول معین و برای سلول‌های دختر در تقسیم استفاده می‌شود؛ شکل 5 را ببینید). نقشه های ما از سرعت رشد سطح سلولی SAM با مشاهدات قبلی 38،39، با حداقل نرخ رشد در مرز و حداکثر نرخ رشد در گل های در حال رشد مطابقت دارد (شکل 5a). تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) نشان داد که فعالیت سیگنالینگ GA با شدت رشد سطح سلولی همبستگی منفی دارد (شکل 5c). ما همچنین نشان دادیم که محورهای اصلی تغییر، از جمله ورودی سیگنال‌دهی GA و شدت رشد، متعامد به جهت تعیین‌شده توسط بیان بالای CLV3 بودند، که خروج سلول‌ها از مرکز SAM را در آنالیزهای باقی‌مانده تأیید کرد. تجزیه و تحلیل همبستگی اسپیرمن نتایج PCA را تایید کرد (شکل 5d)، که نشان می‌دهد سیگنال‌های GA بالاتر در IPR منجر به گسترش بیشتر سلولی نمی‌شود. با این حال، تجزیه و تحلیل همبستگی یک همبستگی مثبت خفیف بین فعالیت سیگنال دهی GA و ناهمسانگردی رشد را نشان داد (شکل 5c، d)، که نشان می دهد سیگنال دهی GA بالاتر در IPR بر جهت رشد سلول و احتمالاً موقعیت صفحه تقسیم سلولی تأثیر می گذارد.
a، b نقشه‌های حرارتی میانگین رشد سطحی (a) و ناهمسانگردی رشد (b) در SAM به طور میانگین بیش از هفت گیاه مستقل (به ترتیب به عنوان نماینده‌ای برای قدرت و جهت گسترش سلول استفاده می‌شوند). c تجزیه و تحلیل PCA شامل متغیرهای زیر بود: سیگنال GA، شدت رشد سطح، ناهمسانگردی رشد سطح، و بیان CLV3. جزء 1 PCA عمدتاً با شدت رشد سطحی همبستگی منفی و با سیگنال GA همبستگی مثبت داشت. جزء 2 PCA عمدتاً با ناهمسانگردی رشد سطح و با بیان CLV3 همبستگی منفی داشت. درصدها نشان دهنده تغییرات توضیح داده شده توسط هر جزء است. d تجزیه و تحلیل همبستگی اسپیرمن بین سیگنال GA، شدت رشد سطح، و ناهمسانگردی رشد سطح در مقیاس بافت به استثنای CZ. عدد سمت راست مقدار Spearman rho بین دو متغیر است. ستاره ها مواردی را نشان می دهند که همبستگی/همبستگی منفی بسیار معنی دار است. تجسم سه بعدی سلول های Col-0 SAM L1 توسط میکروسکوپ کانفوکال. دیواره های سلولی جدیدی که در SAM (اما نه پریموردیوم) در 10 ساعت تشکیل شده اند، با توجه به مقادیر زاویه آنها رنگ می شوند. نوار رنگ در گوشه سمت راست پایین نشان داده شده است. ورودی تصویر 3 بعدی مربوطه را در 0 ساعت نشان می دهد. آزمایش دو بار با نتایج مشابه تکرار شد. f نمودارهای جعبه نرخ تقسیم سلولی را در IPR و غیر IPR Col-0 SAM (تعداد = 10 گیاه مستقل) نشان می دهد. خط مرکزی میانه را نشان می دهد و مرزهای جعبه صدک های 25 و 75 را نشان می دهد. Whiskers حداقل و حداکثر مقادیر تعیین شده با نرم افزار R را نشان می دهد. مقادیر P با آزمون t دو دنباله ولش به دست آمد. g، h نمودار شماتیکی که نشان می دهد (g) نحوه اندازه گیری زاویه دیواره سلولی جدید (سرخابی) با توجه به جهت شعاعی از مرکز SAM (خط نقطه چین سفید) (فقط مقادیر زاویه حاد، یعنی 0-90 درجه در نظر گرفته می شود)، و (h) جهت های محیطی/جانبی و شعاعی در مریستم. i هیستوگرام فرکانس جهت صفحه تقسیم سلولی در سراسر SAM (آبی تیره)، IPR (آبی متوسط)، و غیر IPR (آبی روشن)، به ترتیب. مقادیر P با آزمون کولموگروف اسمیرنوف دو طرفه به دست آمد. آزمایش دو بار با نتایج مشابه تکرار شد. j هیستوگرام فرکانس جهت صفحه تقسیم سلولی IPR به ترتیب در اطراف P3 (سبز روشن)، P4 (سبز متوسط) و P5 (سبز تیره). مقادیر P با آزمون کولموگروف اسمیرنوف دو طرفه به دست آمد. آزمایش دو بار با نتایج مشابه تکرار شد.
بنابراین، ما در مرحله بعد ارتباط بین سیگنال دهی GA و فعالیت تقسیم سلولی را با شناسایی دیواره های سلولی تازه تشکیل شده در طول آزمایش بررسی کردیم (شکل 5e). این رویکرد به ما امکان داد فرکانس و جهت تقسیم سلولی را اندازه گیری کنیم. با کمال تعجب، ما دریافتیم که فراوانی تقسیمات سلولی در IPR و بقیه SAM (غیر IPR، شکل 5f) مشابه بود، که نشان می‌دهد تفاوت در سیگنال‌دهی GA بین سلول‌های IPR و غیرIPR تأثیر قابل‌توجهی بر تقسیم سلولی ندارد. این، و همبستگی مثبت بین سیگنال دهی GA و ناهمسانگردی رشد، ما را بر آن داشت تا در نظر بگیریم که آیا فعالیت سیگنالینگ GA می تواند جهت گیری صفحه تقسیم سلولی را تحت تأثیر قرار دهد یا خیر. ما جهت‌گیری دیواره سلولی جدید را به‌عنوان یک زاویه حاد نسبت به محور شعاعی که مرکز مریستم و مرکز دیواره سلولی جدید را به هم متصل می‌کند اندازه‌گیری کردیم (شکل 5e-i) و تمایل واضحی را برای تقسیم سلول‌ها در زوایای نزدیک به 90 درجه نسبت به محور شعاعی مشاهده کردیم، با بالاترین فرکانس‌ها در 80 درجه و 80-83 تا 80 درصد مشاهده شد. (22.62%) (شکل 5e,i)، مربوط به تقسیمات سلولی در جهت محیطی/عرضی (شکل 5h). برای بررسی سهم سیگنال دهی GA در این رفتار تقسیم سلولی، پارامترهای تقسیم سلولی را در IPR و غیرIPR به طور جداگانه تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 5i). مشاهده کردیم که توزیع زاویه تقسیم در سلول‌های IPR با سلول‌های غیر IPR یا در سلول‌های کل SAM متفاوت است، با سلول‌های IPR نسبت بیشتری از تقسیم‌بندی سلولی جانبی/دایره‌ای را نشان می‌دهند، یعنی 70-80 درجه و 80-90 درجه (به ترتیب 33.86٪ و 30.71٪) (به ترتیب، به نسبت). بنابراین، مشاهدات ما یک ارتباط بین سیگنال دهی GA بالا و جهت صفحه تقسیم سلولی نزدیک به جهت محیطی، مشابه همبستگی بین فعالیت سیگنال دهی GA و ناهمسانگردی رشد را نشان داد (شکل 5c، d). برای ایجاد بیشتر حفاظت فضایی این ارتباط، جهت گیری صفحه تقسیم را در سلول های IPR احاطه کننده پریموردیوم با شروع از P3 اندازه گیری کردیم، زیرا بالاترین فعالیت سیگنال دهی GA در این منطقه با شروع از P4 شناسایی شد (شکل 4). زوایای تقسیم IPR در اطراف P3 و P4 از نظر آماری تفاوت معنی‌داری نشان نداد، اگرچه افزایش فراوانی تقسیم سلولی جانبی در IPR در اطراف P4 مشاهده شد (شکل 5j). با این حال، در سلول های IPR در اطراف P5، تفاوت در جهت صفحه تقسیم سلولی از نظر آماری معنی دار شد، با افزایش شدید فرکانس تقسیم سلولی عرضی (شکل 5j). با هم، این نتایج نشان می‌دهد که سیگنال‌دهی GA می‌تواند جهت‌گیری تقسیمات سلولی را در SAM کنترل کند، که با گزارش‌های قبلی مطابقت دارد.
پیش‌بینی می‌شود که سلول‌ها در IPR به پریموردیا اضافه نمی‌شوند، بلکه در میانگره‌ها 2،42،43 قرار می‌گیرند. جهت عرضی تقسیمات سلولی در IPR ممکن است منجر به سازماندهی معمولی ردیف‌های طولی موازی سلول‌های اپیدرمی در میانگره‌ها شود. مشاهدات ما که در بالا توضیح داده شد نشان می دهد که سیگنال دهی GA احتمالاً با تنظیم جهت تقسیم سلولی در این فرآیند نقش دارد.
از دست دادن عملکرد چندین ژن DELLA منجر به یک پاسخ سازنده GA می شود و از della mutants می توان برای آزمایش این فرضیه استفاده کرد. ما ابتدا الگوهای بیان پنج ژن DELLA را در SAM تجزیه و تحلیل کردیم. ادغام رونویسی خط GUS45 نشان داد که GAI، RGA، RGL1، و RGL2 (به میزان بسیار کمتر) در SAM بیان شده اند (شکل تکمیلی 11a-d). هیبریداسیون درجا نشان داد که mRNA ژن GAI به طور خاص در گلهای اولیه و در حال رشد تجمع می یابد (شکل تکمیلی 11e). mRNA ژن RGL1 و RGL3 در سراسر تاج SAM و در گل‌های مسن‌تر شناسایی شدند، در حالی که mRNA RGL2 در ناحیه مرزی فراوان‌تر بود (شکل تکمیلی 11f-h). تصویربرداری کانفوکال pRGL3::RGL3-GFP SAM بیان مشاهده شده توسط هیبریداسیون درجا را تایید کرد و نشان داد که پروتئین RGL3 در قسمت مرکزی SAM تجمع می یابد (شکل تکمیلی 11i). با استفاده از خط pRGA::GFP-RGA، ما همچنین دریافتیم که پروتئین RGA در SAM تجمع می یابد، اما فراوانی آن در مرز با شروع از P4 کاهش می یابد (شکل تکمیلی 11j). قابل توجه، الگوهای بیان RGL3 و RGA با فعالیت سیگنال دهی بالاتر GA در IPR مطابق است، همانطور که توسط qmRGA شناسایی شده است (شکل 4). علاوه بر این، این داده‌ها نشان می‌دهند که همه DELLAها در SAM بیان می‌شوند و بیان آن‌ها در مجموع کل SAM را در بر می‌گیرد.
سپس پارامترهای تقسیم سلولی را در نوع وحشی SAM (Ler، کنترل) و gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della پنجگانه (جهانی) جهش (شکل 6a, b) تجزیه و تحلیل کردیم. جالب توجه است، ما یک تغییر آماری معنی‌دار را در توزیع فرکانس‌های زاویه تقسیم سلولی در SAM جهش‌یافته della global در مقایسه با نوع وحشی مشاهده کردیم (شکل 6c). این تغییر در جهش جهانی della به دلیل افزایش فرکانس زوایای 80-90 درجه (34.71٪ در مقابل 24.55٪) و به میزان کمتر، زوایای 70-80 درجه (23.78٪ در مقابل 20.18٪) بود، یعنی مربوط به تقسیمات سلولی عرضی (شکل 6c). فراوانی تقسیمات غیر عرضی (0-60 درجه) نیز در جهش جهانی della کمتر بود (شکل 6c). فرکانس تقسیمات سلولی عرضی به طور قابل توجهی در SAM جهش جهانی della افزایش یافت (شکل 6b). فراوانی تقسیمات سلولی عرضی در IPR نیز در جهش جهانی della در مقایسه با نوع وحشی بیشتر بود (شکل 6d). در خارج از منطقه IPR، نوع وحشی توزیع یکنواخت تری از زوایای تقسیم سلولی داشت، در حالی که جهش یافته جهانی della تقسیمات مماسی مانند IPR را ترجیح می داد (شکل 6e). ما همچنین جهت گیری تقسیمات سلولی را در SAM جهش‌یافته‌های پنجگانه ga2 اکسیداز (ga2ox) (ga2ox1-1، ga2ox2-1، ga2ox3-1، ga2ox4-1، و ga2ox6-2)، یک پس‌زمینه جهش‌یافته غیرفعال GA که در آن GA تجمع می‌یابد، کمی کردیم. مطابق با افزایش سطوح GA، SAM گل آذین جهش یافته ga2ox پنج گانه بزرگتر از گل آذین Col-0 بود (تصویر تکمیلی 12a, b) و در مقایسه با Col-0، ga2ox SAM پنج گانه توزیع متفاوتی از تقسیم فرکانس سلولی را از 9 درجه به زوایای تقسیم سلولی دوباره از 950 درجه نشان داد. تقسیمات (شکل تکمیلی 12a-c). بنابراین، ما نشان می‌دهیم که فعال‌سازی سازنده سیگنال‌دهی GA و تجمع GA باعث القای تقسیمات سلولی جانبی در IPR و بقیه SAM می‌شود.
a، b تجسم سه بعدی لایه L1 لر (a) رنگ آمیزی شده با PI و جهش یافته جهانی della (b) SAM با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال. دیواره های سلولی جدیدی که در SAM (اما نه پریموردیوم) در طی یک دوره 10 ساعته تشکیل شده اند، با توجه به مقادیر زاویه آنها نشان داده شده و رنگ می شوند. ورودی SAM را در 0 ساعت نشان می دهد. نوار رنگ در گوشه پایین سمت راست نمایش داده می شود. فلش در (b) به نمونه ای از فایل های سلولی تراز شده در جهش جهانی دلا اشاره می کند. آزمایش دو بار با نتایج مشابه تکرار شد. مقایسه توزیع فرکانس جهت‌گیری‌های صفحه تقسیم سلولی در کل SAM (d)، IPR (e)، و غیر IPR (f) بین Ler و della جهانی. مقادیر P با استفاده از آزمون کولموگروف-اسمیرنوف دو دنباله به دست آمد. f، g تجسم سه بعدی تصاویر هم کانونی از گیاهان تراریخته با رنگ آمیزی PI از Col-0 (i) و pCUC2::gai-1-VENUS (j). پانل‌های (a, b) دیواره‌های سلولی جدید (اما نه پریموردیا) را نشان می‌دهند که در SAM در عرض 10 ساعت تشکیل شده‌اند. آزمایش دو بار با نتایج مشابه تکرار شد. h-j مقایسه توزیع فرکانس جهت‌گیری‌های صفحه تقسیم سلولی واقع در کل SAM (h)، IPR (i) و غیر IPR (j) بین گیاهان Col-0 و pCUC2::gai-1-VENUS. مقادیر P با استفاده از آزمون کولموگروف-اسمیرنوف دو دنباله به دست آمد.
ما بعداً اثر مهار سیگنالینگ GA را به طور خاص در IPR آزمایش کردیم. برای این منظور، ما از پروموتر لپه کاپ 2 (CUC2) برای هدایت بیان یک پروتئین غالب منفی gai-1 که با VENUS ذوب شده است (در خط pCUC2::gai-1-VENUS) استفاده کردیم. در SAM نوع وحشی، پروموتر CUC2 بیان بیشتر IPRها را در SAM، از جمله سلول های مرزی، از P4 به بعد هدایت می کند، و بیان خاص مشابهی در گیاهان pCUC2::gai-1-VENUS مشاهده شد (به زیر مراجعه کنید). توزیع زوایای تقسیم سلولی در سراسر SAM یا IPR گیاهان pCUC2::gai-1-VENUS تفاوت قابل توجهی با نوع وحشی نداشت، اگرچه به طور غیرمنتظره ای دریافتیم که سلول های بدون IPR در این گیاهان در فرکانس بالاتر 80-90 درجه تقسیم شدند (شکل 6f-j).
پیشنهاد شده است که جهت تقسیم سلولی به هندسه SAM، به ویژه تنش کششی ایجاد شده توسط انحنای بافت بستگی دارد. بنابراین ما پرسیدیم که آیا شکل SAM در گیاهان جهش یافته della global و pCUC2::gai-1-VENUS تغییر کرده است یا خیر. همانطور که قبلاً گزارش شده بود12، اندازه جهش یافته جهانی della بزرگتر از نوع وحشی بود (تصویر تکمیلی 13a, b, d). هیبریداسیون درجا CLV3 و STM RNA گسترش مریستم را در جهش‌یافته دلا تأیید کرد و بیشتر گسترش جانبی طاقچه سلول‌های بنیادی را نشان داد (شکل تکمیلی 13e, f, h, i). با این حال، انحنای SAM در هر دو ژنوتیپ مشابه بود (شکل تکمیلی 13k، m، n، p). ما افزایش مشابهی در اندازه را در جهش چهارگانه gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 دلا بدون تغییر در انحنا در مقایسه با نوع وحشی مشاهده کردیم (شکل تکمیلی 13c, d, g, j, l, o, p). فرکانس جهت تقسیم سلولی نیز در جهش چهارگانه دلا تحت تأثیر قرار گرفت، اما به میزان کمتری نسبت به جهش یکپارچه دلا (شکل تکمیلی 12d-f). این اثر دوز، همراه با عدم تأثیر بر انحنا، نشان می‌دهد که فعالیت باقی‌مانده RGL3 در جهش چهارگانه دلا، تغییرات در جهت تقسیم سلولی ناشی از از دست دادن فعالیت DELLA را محدود می‌کند و تغییرات در تقسیمات سلولی جانبی در پاسخ به تغییرات در فعالیت سیگنال‌دهی GA به جای تغییرات در هندسه SAM رخ می‌دهد. همانطور که در بالا توضیح داده شد، پروموتر CUC2 بیان IPR را در SAM با شروع از P4 هدایت می کند (شکل تکمیلی 14a، b)، و در مقابل، pCUC2::gai-1-VENUS SAM اندازه کاهش یافته اما انحنای بالاتری داشت (شکل تکمیلی 14c-h). این تغییر در مورفولوژی pCUC2::gai-1-VENUS SAM ممکن است منجر به توزیع متفاوت تنش‌های مکانیکی در مقایسه با نوع وحشی شود، که در آن تنش‌های محیطی بالا از فاصله کوتاه‌تری از مرکز SAM شروع می‌شود. از طرف دیگر، تغییرات در مورفولوژی pCUC2::gai-1-VENUS SAM ممکن است ناشی از تغییرات در خواص مکانیکی منطقه‌ای ناشی از بیان تراریخته باشد. در هر دو مورد، این می‌تواند تا حدی اثرات تغییرات در سیگنال‌دهی GA را با افزایش احتمال تقسیم سلول‌ها در جهت محیطی/عرضی جبران کند و مشاهدات ما را توضیح دهد.
روی هم، داده‌های ما تأیید می‌کنند که سیگنال‌دهی GA بالاتر نقش فعالی در جهت‌گیری جانبی صفحه تقسیم سلولی در IPR ایفا می‌کند. آنها همچنین نشان می‌دهند که انحنای مریستم نیز بر جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی در IPR تأثیر می‌گذارد.
جهت عرضی صفحه تقسیم در IPR، به دلیل فعالیت سیگنالینگ GA بالا، نشان می دهد که GA یک فایل سلولی شعاعی را در اپیدرم در داخل SAM از قبل سازماندهی می کند تا سازمان سلولی را که بعداً در میانگره اپیدرمی یافت می شود، تعریف کند. در واقع، چنین فایل های سلولی اغلب در تصاویر SAM جهش یافته های جهانی della قابل مشاهده بودند (شکل 6b). بنابراین، برای بررسی بیشتر عملکرد رشدی الگوی فضایی سیگنال‌دهی GA در SAM، از تصویربرداری با گذشت زمان برای تجزیه و تحلیل سازمان فضایی سلول‌ها در IPR در گیاهان تراریخته نوع وحشی (Ler و Col-0)، della global mutants و pCUC2::gai-1-VENUS استفاده کردیم.
ما دریافتیم که qmRGA نشان داد که فعالیت سیگنال دهی GA در IPR از P1/P2 افزایش یافته و در P4 به اوج خود رسید و این الگو در طول زمان ثابت ماند (شکل 4a-f و شکل تکمیلی 8c-f, k). برای تجزیه و تحلیل سازمان فضایی سلول‌ها در IPR با افزایش سیگنال GA، سلول‌های Ler IPR را در بالا و کناره‌های P4 با توجه به سرنوشت تکاملی آن‌ها که 34 ساعت پس از اولین مشاهده مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت، برچسب‌گذاری کردیم، یعنی بیش از دو بار پلاستید، به ما اجازه می‌دهد سلول‌های IPR را در طول توسعه پریموردیوم از P1/P2 تا P4 دنبال کنیم. ما از سه رنگ مختلف استفاده کردیم: زرد برای آن دسته از سلول هایی که در پریموردیوم نزدیک P4 ادغام شده بودند، سبز برای آنهایی که در IPR بودند و بنفش برای آنهایی که در هر دو فرآیند شرکت داشتند (شکل 7a-c). در t0 (0 ساعت)، 1-2 لایه از سلول های IPR در مقابل P4 قابل مشاهده بود (شکل 7a). همانطور که انتظار می رفت، هنگامی که این سلول ها تقسیم شدند، این کار را عمدتاً از طریق صفحه تقسیم عرضی انجام دادند (شکل 7a-c). نتایج مشابهی با استفاده از Col-0 SAM (با تمرکز بر P3، که چین های مرزی آن مشابه P4 در Ler است) به دست آمد، اگرچه در این ژنوتیپ چین های تشکیل شده در مرز گل، سلول های IPR را سریعتر پنهان می کند (شکل 7g-i). بنابراین، الگوی تقسیم سلول‌های IPR، سلول‌ها را از قبل به ردیف‌های شعاعی مانند میانگره‌ها سازماندهی می‌کند. سازماندهی ردیف های شعاعی و محل قرارگیری سلول های IPR بین اندام های متوالی نشان می دهد که این سلول ها اجداد بین گرهی هستند.
در اینجا، ما یک حسگر زیستی سیگنالینگ نسبت سنجی GA، qmRGA، ایجاد کردیم که به نقشه برداری کمی از فعالیت سیگنالینگ GA ناشی از غلظت های ترکیبی گیرنده GA و GA اجازه می دهد در حالی که تداخل با مسیرهای سیگنال دهی درون زا را به حداقل می رساند، در نتیجه اطلاعاتی در مورد عملکرد GA در سطح سلولی ارائه می دهد. برای این منظور، ما یک پروتئین DELLA اصلاح شده، mRGA، ساختیم که توانایی اتصال شرکای تعامل DELLA را از دست داده است، اما به پروتئولیز ناشی از GA حساس است. qmRGA به هر دو تغییرات برون زا و درون زا در سطوح GA پاسخ می دهد و ویژگی های حسگر پویا آن را قادر می سازد تا تغییرات مکانی-زمانی در فعالیت سیگنالینگ GA را در طول توسعه ارزیابی کند. qmRGA همچنین یک ابزار بسیار انعطاف‌پذیر است زیرا می‌تواند با تغییر پروموتر مورد استفاده برای بیان آن (در صورت لزوم) با بافت‌های مختلف سازگار شود، و با توجه به ماهیت حفاظت‌شده مسیر سیگنال‌دهی GA و موتیف PFYRE در بین آنژیوسپرم‌ها، احتمالاً قابل انتقال به گونه‌های دیگر است. مطابق با این، یک جهش معادل در پروتئین SLR1 DELLA برنج (HYY497AAA) نیز نشان داده شد که فعالیت سرکوبگر رشد SLR1 را سرکوب می کند در حالی که فقط کمی تخریب آن را با واسطه GA کاهش می دهد، مشابه mRGA23. شایان ذکر است، مطالعات اخیر در Arabidopsis نشان داد که یک جهش اسید آمینه منفرد در حوزه PFYRE (S474L) فعالیت رونویسی RGA را بدون تأثیر بر توانایی آن در تعامل با شرکای فاکتور رونویسی تغییر داد. اگرچه این جهش بسیار نزدیک به 3 جایگزینی اسید آمینه موجود در mRGA است، مطالعات ما نشان می دهد که این دو جهش ویژگی های متمایز DELLA را تغییر می دهند. اگرچه اکثر شرکای فاکتور رونویسی به دامنه های LHR1 و SAW DELLA26،51 متصل می شوند، برخی از اسیدهای آمینه حفاظت شده در حوزه PFYRE ممکن است به تثبیت این برهمکنش ها کمک کنند.
توسعه میانگره یک ویژگی کلیدی در معماری گیاه و بهبود عملکرد است. qmRGA فعالیت سیگنالینگ GA بالاتری را در سلول های پیش ساز میانگره IPR نشان داد. با ترکیب تصویربرداری کمی و ژنتیک، ما نشان دادیم که الگوهای سیگنالینگ GA صفحات تقسیم سلولی دایره‌ای/عرضی را در اپیدرم SAM قرار می‌دهند و سازمان تقسیم سلولی مورد نیاز برای توسعه بینگره را شکل می‌دهند. چندین تنظیم کننده جهت گیری صفحه تقسیم سلولی در طول توسعه شناسایی شده است52،53. کار ما مثال واضحی از نحوه تنظیم فعالیت سیگنالینگ GA این پارامتر سلولی را ارائه می دهد. DELLA می‌تواند با کمپلکس‌های پروتئینی از پیش تاشده تعامل کند، بنابراین سیگنال‌دهی GA ممکن است جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی را با تأثیر مستقیم بر جهت‌گیری میکروتوبول‌های قشر مغز تنظیم کند. ما به طور غیر منتظره نشان دادیم که در SAM، همبستگی فعالیت سیگنالینگ GA بالاتر، ازدیاد طول یا تقسیم سلولی نیست، بلکه فقط ناهمسانگردی رشد است، که با اثر مستقیم GA بر جهت تقسیم سلولی در IPR سازگار است. با این حال، نمی‌توانیم این اثر را غیرمستقیم نیز رد کنیم، برای مثال با واسطه نرم شدن دیواره سلولی ناشی از GA56. تغییرات در ویژگی‌های دیواره سلولی باعث ایجاد استرس مکانیکی می‌شود. اثرات ترکیبی تنش مکانیکی ناشی از GA و تنظیم مستقیم جهت‌گیری میکروتوبول‌ها توسط GA ممکن است در ایجاد یک الگوی خاص جهت‌گیری تقسیم سلولی در IPR برای تعریف میانگره‌ها نقش داشته باشد و مطالعات بیشتری برای آزمایش این ایده مورد نیاز است. به طور مشابه، مطالعات قبلی اهمیت پروتئین‌های تعامل‌کننده TCP14 و 15 با DELLA را در کنترل تشکیل میانگره‌ها نشان داده‌اند و این عوامل ممکن است واسطه‌ی عمل GA همراه با BREVIPEDICELLUS (BP) و PENNYWISE (PNY) باشند که توسعه میانگره را تنظیم می‌کنند و نشان داده شده است که سیگنال GA22 را تحت تأثیر قرار می‌دهند. با توجه به اینکه DELLA ها با مسیرهای سیگنالینگ براسینواستروئید، اتیلن، اسید جاسمونیک و اسید آبسیزیک (ABA) 63،64 تعامل دارند و این هورمون ها می توانند جهت گیری میکروتوبول را تحت تاثیر قرار دهند، اثرات GA بر جهت گیری تقسیم سلولی نیز ممکن است توسط هورمون های دیگر واسطه شود.
مطالعات سیتولوژیک اولیه نشان داد که هر دو ناحیه داخلی و خارجی آرابیدوپسیس SAM برای توسعه بینگره مورد نیاز است. این واقعیت که GA به طور فعال تقسیم سلولی را در بافت‌های داخلی تنظیم می‌کند، از عملکرد دوگانه GA در تنظیم اندازه مریستم و بینگره در SAM پشتیبانی می‌کند. الگوی تقسیم سلولی جهت دار نیز در بافت SAM داخلی به شدت تنظیم می شود و این تنظیم برای رشد ساقه ضروری است. بررسی اینکه آیا GA همچنین نقشی در جهت‌دهی صفحه تقسیم سلولی در سازمان SAM داخلی دارد یا خیر، و در نتیجه مشخصات و توسعه میانگره‌ها را در SAM همگام‌سازی می‌کند، جالب خواهد بود.
گیاهان در شرایط آزمایشگاهی در خاک یا محیط کشت موراشیگه-اسکوگ (MS) 1 برابر (Duchefa) همراه با 1 درصد ساکارز و 1 درصد آگار (سیگما) در شرایط استاندارد (نور 16 ساعت، 22 درجه سانتیگراد)، به جز آزمایش‌های هیپوکوتیل و رشد ریشه که در آن نهال‌ها در صفحات عمودی 22 درجه سانتی‌گراد و تحت نور ثابت رشد کردند. برای آزمایش نیترات، گیاهان بر روی محیط کشت اصلاح شده MS (محیط گیاهی bioWORLD) همراه با نیترات کافی (0 یا 10 میلی مولار KNO3)، 0.5 میلی مولار NH4-سوکسینات، 1٪ ساکارز و 1٪ A-آگار (سیگما) تحت شرایط روز طولانی رشد کردند.
cDNA GID1a وارد شده در pDONR221 با pDONR P4-P1R-pUBQ10 و pDONR P2R-P3-mCherry در pB7m34GW برای تولید pUBQ10::GID1a-mCherry دوباره ترکیب شد. DNA IDD2 وارد شده در pDONR221 در pB7RWG266 برای تولید p35S:IDD2-RFP دوباره ترکیب شد. برای تولید pGID1b::2xmTQ2-GID1b، یک قطعه 3.9 کیلوبایتی در بالادست منطقه کدکننده GID1b و یک قطعه 4.7 کیلوبایتی حاوی cDNA GID1b (1.3 کیلوبایت) و پایان‌دهنده (3.4 کیلوبایت) ابتدا با استفاده از آغازگرهای موجود در جدول تکمیلی، سپس در جدول تکمیلی P4R1 و سپس ONR4 در p3 و سپس ONR1 در p. Fisher Scientific) و pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific)، به ترتیب، و در نهایت با pDONR221 2xmTQ268 در وکتور هدف pGreen 012567 با استفاده از شبیه سازی Gateway دوباره ترکیب شدند. برای تولید pCUC2:: LSSmOrange، توالی پروموتر CUC2 (3229 جفت باز در بالادست ATG) و به دنبال آن دنباله کدکننده مولاورنج بزرگ با جابجایی استوکس (LSSmOrange)69 با سیگنال محلی سازی هسته ای N7 و پایان دهنده رونویسی NOS با استفاده از رگه رهگیری G در مسیر p. سیستم نوترکیبی 3 قطعه ای (اینویتروژن). ناقل دوتایی گیاهی به ترتیب به سویه Agrobacterium tumefaciens با استفاده از روش نفوذ آگروباکتریوم به برگهای Nicotiana benthamiana و به روش غوطه وری گلدار به Arabidopsis thaliana Col-0 وارد شد. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry و pCLV3::mCherry-NLS qmRGA به ترتیب از فرزندان F3 و F1 تلاقی های مربوطه جدا شد.
هیبریداسیون RNA در محل بر روی نوک های شاخساره به طول تقریبی 1 سانتی متر72 انجام شد که جمع آوری و بلافاصله در محلول FAA (3.7٪ فرمالدئید، 5٪ اسید استیک، 50٪ اتانول) از قبل خنک شده تا 4 درجه سانتیگراد ثابت شدند. پس از 2 × 15 دقیقه وکیوم تیمار، فیکساتور تعویض شد و نمونه ها یک شبه انکوبه شدند. cDNA های GID1a، GID1b، GID1c، GAI، RGL1، RGL2، و RGL3 و پروب های آنتی سنس برای 3'-UTR های آنها با استفاده از آغازگرهای نشان داده شده در جدول تکمیلی 3 همانطور که توسط Rosier و همکاران 73 توضیح داده شده است، سنتز شدند. پروب های نشاندار شده با دیگوکسیژنین با استفاده از آنتی بادی های دیگوکسیژنین (رقت 3000 برابری؛ روش، شماره کاتالوگ: 11 093 274 910) شناسایی شدند، و برش ها با 5-برومو-4-کلرو-3-ایندولیل فسفات (BCIP-5-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0) رنگ آمیزی شدند. محلول (NBT، رقت 200 برابری).