حسگر زیستی کمی جیبرلین، نقش جیبرلین‌ها را در تعیین مشخصات میانگره در مریستم رأسی ساقه آشکار می‌کند.

رشد مریستم رأسی ساقه (SAM) برای ساختار ساقه حیاتی است. هورمون‌های گیاهیجیبرلین‌ها(GAs) نقش‌های کلیدی در هماهنگی رشد گیاه ایفا می‌کنند، اما نقش آنها در SAM هنوز به خوبی شناخته نشده است. در اینجا، ما یک حسگر زیستی نسبت‌سنجی از سیگنال‌دهی GA را با مهندسی پروتئین DELLA برای سرکوب عملکرد تنظیمی ضروری آن در پاسخ رونویسی GA و در عین حال حفظ تخریب آن پس از شناسایی GA توسعه دادیم. ما نشان می‌دهیم که این حسگر زیستی مبتنی بر تخریب، تغییرات در سطح GA و سنجش سلولی را در طول توسعه به طور دقیق ثبت می‌کند. ما از این حسگر زیستی برای نقشه‌برداری از فعالیت سیگنال‌دهی GA در SAM استفاده کردیم. ما نشان می‌دهیم که سیگنال‌های بالای GA عمدتاً در سلول‌های واقع در بین پریموردیاهای اندام وجود دارند که پیش‌ساز سلول‌های میانگره‌ای هستند. با استفاده از رویکردهای افزایش و از دست دادن عملکرد، ما همچنین نشان می‌دهیم که GA جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی را تنظیم می‌کند، سازماندهی سلولی متعارف میانگره‌ها را ایجاد می‌کند و در نتیجه مشخصات میانگره را در SAM ارتقا می‌دهد.
مریستم رأسی شاخه (SAM)، واقع در رأس شاخه، حاوی جایگاهی از سلول‌های بنیادی است که فعالیت آنها اندام‌های جانبی و گره‌های ساقه را به صورت مدولار و تکراری در طول زندگی گیاه تولید می‌کند. هر یک از این واحدهای تکرارشونده یا گره‌های گیاهی، شامل میانگره‌ها و اندام‌های جانبی در گره‌ها و مریستم‌های جانبی در محور برگ‌ها می‌شود.1 رشد و سازماندهی گره‌های گیاهی در طول رشد تغییر می‌کند. در آرابیدوپسیس، رشد میانگره‌ها در مرحله رویشی سرکوب می‌شود و مریستم‌های جانبی در محور برگ‌های رزت غیرفعال می‌مانند. در طول گذار به مرحله گل‌دهی، SAM به مریستم گل‌آذین تبدیل می‌شود و میانگره‌های کشیده و جوانه‌های جانبی، شاخه‌های فرعی در محور برگ‌های دمگلی و بعداً گل‌های بدون برگ را ایجاد می‌کند.2 اگرچه ما در درک مکانیسم‌هایی که شروع برگ‌ها، گل‌ها و شاخه‌ها را کنترل می‌کنند، پیشرفت قابل توجهی داشته‌ایم، اما اطلاعات نسبتاً کمی در مورد چگونگی پیدایش میانگره‌ها وجود دارد.
درک توزیع مکانی-زمانی GAها به درک بهتر عملکرد این هورمون‌ها در بافت‌های مختلف و در مراحل مختلف رشد کمک خواهد کرد. تجسم تخریب ادغام RGA-GFP که تحت عمل پروموتر خود بیان می‌شود، اطلاعات مهمی در مورد تنظیم سطح کل GA در ریشه‌ها ارائه می‌دهد15،16. با این حال، بیان RGA در بافت‌های مختلف متفاوت است17 و توسط GA18 تنظیم می‌شود. بنابراین، بیان متفاوت پروموتر RGA ممکن است منجر به الگوی فلورسانس مشاهده شده با RGA-GFP شود و بنابراین این روش کمی نیست. اخیراً، GA19،20 نشاندار شده با فلورسین زیست فعال (Fl) تجمع GA را در اندوکورتکس ریشه و تنظیم سطوح سلولی آن توسط انتقال GA نشان داد. اخیراً، حسگر GA FRET nlsGPS1 نشان داد که سطح GA با طویل شدن سلول در ریشه‌ها، رشته‌ها و هیپوکوتیل‌های رشد یافته در تاریکی همبستگی دارد21. با این حال، همانطور که دیده‌ایم، غلظت GA تنها پارامتر کنترل‌کننده فعالیت سیگنالینگ GA نیست، زیرا به فرآیندهای حسگری پیچیده‌ای بستگی دارد. در اینجا، با تکیه بر درک خود از مسیرهای سیگنالینگ DELLA و GA، توسعه و توصیف یک حسگر زیستی نسبت‌سنجی مبتنی بر تخریب برای سیگنالینگ GA را گزارش می‌دهیم. برای توسعه این حسگر زیستی کمی، از یک RGA حساس به GA جهش‌یافته که به یک پروتئین فلورسنت متصل شده و به طور فراگیر در بافت‌ها بیان می‌شود، و همچنین از یک پروتئین فلورسنت غیرحساس به GA استفاده کردیم. ما نشان می‌دهیم که اتصال پروتئین‌های RGA جهش‌یافته هنگام بیان فراگیر، با سیگنالینگ GA درون‌زا تداخلی ندارند و این حسگر زیستی می‌تواند فعالیت سیگنالینگ ناشی از ورودی GA و پردازش سیگنال GA توسط دستگاه حسگر را با وضوح مکانی-زمانی بالا کمی‌سازی کند. ما از این حسگر زیستی برای نقشه‌برداری از توزیع مکانی-زمانی فعالیت سیگنالینگ GA و کمی‌سازی چگونگی تنظیم رفتار سلولی توسط GA در اپیدرم SAM استفاده کردیم. ما نشان می‌دهیم که GA جهت‌گیری صفحه تقسیم سلول‌های SAM واقع در بین پریموردیای اندام را تنظیم می‌کند و در نتیجه سازماندهی سلولی متعارف میان‌گره را تعریف می‌کند.
در نهایت، ما پرسیدیم که آیا qmRGA می‌تواند تغییرات در سطوح GA درون‌زا را با استفاده از هیپوکوتیل‌های در حال رشد گزارش کند. ما قبلاً نشان دادیم که نیترات با افزایش سنتز GA و به نوبه خود، تخریب DELLA34، رشد را تحریک می‌کند. بر این اساس، مشاهده کردیم که طول هیپوکوتیل در نهال‌های pUBQ10::qmRGA که تحت تأمین فراوان نیترات (10 میلی‌مولار NO3−) رشد کرده‌اند، به طور قابل توجهی طولانی‌تر از نهال‌های رشد یافته در شرایط کمبود نیترات بود (شکل تکمیلی 6a). مطابق با پاسخ رشد، سیگنال‌های GA در هیپوکوتیل‌های نهال‌های رشد یافته در شرایط 10 میلی‌مولار NO3− بیشتر از نهال‌های رشد یافته در غیاب نیترات بودند (شکل تکمیلی 6b، c). بنابراین، qmRGA همچنین امکان نظارت بر تغییرات در سیگنال‌دهی GA ناشی از تغییرات درون‌زا در غلظت GA را فراهم می‌کند.
برای درک اینکه آیا فعالیت سیگنالینگ GA شناسایی شده توسط qmRGA به غلظت GA و درک GA بستگی دارد، همانطور که بر اساس طراحی حسگر انتظار می‌رود، ما بیان سه گیرنده GID1 را در بافت‌های رویشی و زایشی تجزیه و تحلیل کردیم. در نهال‌ها، خط گزارشگر GID1-GUS نشان داد که GID1a و c در لپه‌ها به میزان زیادی بیان می‌شوند (شکل 3a-c). علاوه بر این، هر سه گیرنده در برگ‌ها، پریموردیای ریشه جانبی، نوک ریشه (به جز کلاهک ریشه GID1b) و سیستم عروقی بیان شدند (شکل 3a-c). در SAM گل‌آذین، سیگنال‌های GUS را فقط برای GID1b و 1c شناسایی کردیم (شکل تکمیلی 7a-c). هیبریداسیون درجا این الگوهای بیان را تأیید کرد و همچنین نشان داد که GID1c به طور یکنواخت در سطوح پایین در SAM بیان می‌شود، در حالی که GID1b بیان بالاتری را در حاشیه SAM نشان می‌دهد (شکل تکمیلی 7d-l). ادغام ترجمه‌ای pGID1b::2xmTQ2-GID1b همچنین طیف درجه‌بندی‌شده‌ای از بیان GID1b را نشان داد، از بیان کم یا بدون بیان در مرکز SAM تا بیان بالا در مرزهای اندام (شکل تکمیلی 7m). بنابراین، گیرنده‌های GID1 به طور یکنواخت در سراسر بافت‌ها و درون آنها توزیع نشده‌اند. در آزمایش‌های بعدی، ما همچنین مشاهده کردیم که بیان بیش از حد GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) حساسیت qmRGA را در هیپوکوتیل‌ها به کاربرد خارجی GA افزایش داد (شکل 3d، e). در مقابل، فلورسانس اندازه‌گیری شده توسط qd17mRGA در هیپوکوتیل نسبت به تیمار GA3 حساس نبود (شکل 3f، g). برای هر دو سنجش، نهال‌ها با غلظت‌های بالای GA (100 میکرومولار GA3) تیمار شدند تا رفتار سریع حسگر ارزیابی شود، جایی که توانایی اتصال به گیرنده GID1 افزایش یافته یا از بین رفته است. این نتایج در مجموع تأیید می‌کنند که حسگر زیستی qmRGA عملکردی ترکیبی به عنوان یک حسگر GA و GA دارد و نشان می‌دهد که بیان افتراقی گیرنده GID1 می‌تواند به طور قابل توجهی میزان تابش حسگر را تعدیل کند.
تا به امروز، توزیع سیگنال‌های GA در SAM هنوز مشخص نیست. بنابراین، ما از گیاهان بیان‌کننده qmRGA و گزارشگر سلول بنیادی pCLV3::mCherry-NLS35 برای محاسبه نقشه‌های کمی با وضوح بالا از فعالیت سیگنال‌دهی GA، با تمرکز بر لایه L1 (اپیدرم؛ شکل 4a، b، به روش‌ها و روش‌های تکمیلی مراجعه کنید) استفاده کردیم، زیرا L1 نقش کلیدی در کنترل رشد SAM ایفا می‌کند36. در اینجا، بیان pCLV3::mCherry-NLS یک نقطه مرجع هندسی ثابت برای تجزیه و تحلیل توزیع مکانی-زمانی فعالیت سیگنال‌دهی GA ارائه داد37. اگرچه GA برای رشد اندام‌های جانبی ضروری در نظر گرفته می‌شود4، مشاهده کردیم که سیگنال‌های GA در پریموردیوم گل (P) از مرحله P3 کم بودند (شکل 4a، b)، در حالی که پریموردیوم‌های جوان P1 و P2 فعالیت متوسطی مشابه با ناحیه مرکزی داشتند (شکل 4a، b). فعالیت سیگنالینگ بالاتر GA در مرزهای پریموردیوم اندام، از P1/P2 (در کناره‌های مرز) شروع شده و در P4 به اوج خود رسید، و همچنین در تمام سلول‌های ناحیه محیطی واقع در بین پریموردیوم‌ها (شکل 4a، b و شکل تکمیلی 8a، b). این فعالیت سیگنالینگ بالاتر GA نه تنها در اپیدرم، بلکه در لایه‌های L2 و L3 بالایی نیز مشاهده شد (شکل تکمیلی 8b). الگوی سیگنال‌های GA شناسایی شده در SAM با استفاده از qmRGA نیز در طول زمان بدون تغییر باقی ماند (شکل تکمیلی 8c-f، k). اگرچه ساختار qd17mRGA به طور سیستماتیک در SAM گیاهان T3 از پنج لاین مستقل که ما به طور مفصل مشخص کردیم، کاهش یافت، اما توانستیم الگوهای فلورسانس به دست آمده با ساختار pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP را تجزیه و تحلیل کنیم (شکل تکمیلی 8g-j، l). در این خط کنترل، تنها تغییرات جزئی در نسبت فلورسانس در SAM شناسایی شد، اما در مرکز SAM کاهش واضح و غیرمنتظره‌ای در VENUS مرتبط با TagBFP مشاهده کردیم. این موضوع تأیید می‌کند که الگوی سیگنال‌دهی مشاهده‌شده توسط qmRGA نشان‌دهنده تخریب وابسته به GA از mRGA-VENUS است، اما همچنین نشان می‌دهد که qmRGA ممکن است فعالیت سیگنال‌دهی GA را در مرکز مریستم بیش از حد تخمین بزند. به طور خلاصه، نتایج ما یک الگوی سیگنال‌دهی GA را نشان می‌دهد که در درجه اول نشان‌دهنده توزیع پریموردیا است. این توزیع ناحیه بین پریموردیا (IPR) به دلیل ایجاد تدریجی فعالیت سیگنال‌دهی بالای GA بین پریموردیوم در حال توسعه و ناحیه مرکزی است، در حالی که همزمان فعالیت سیگنال‌دهی GA در پریموردیوم کاهش می‌یابد (شکل 4c، d).
توزیع گیرنده‌های GID1b و GID1c (به بالا مراجعه کنید) نشان می‌دهد که بیان متفاوت گیرنده‌های GA به شکل‌دهی الگوی فعالیت سیگنالینگ GA در SAM کمک می‌کند. ما بررسی کردیم که آیا تجمع متفاوت GA ممکن است در این امر دخیل باشد یا خیر. برای بررسی این احتمال، از حسگر FRET GA nlsGPS1 استفاده کردیم21. افزایش فرکانس فعال‌سازی در SAM مربوط به nlsGPS1 تیمار شده با 10 میکرومولار GA4+7 به مدت 100 دقیقه مشاهده شد (شکل تکمیلی 9a-e)، که نشان می‌دهد nlsGPS1 به تغییرات غلظت GA در SAM پاسخ می‌دهد، همانطور که در ریشه‌ها نیز پاسخ می‌دهد21. توزیع مکانی فرکانس فعال‌سازی nlsGPS1 سطوح نسبتاً پایین GA را در لایه‌های بیرونی SAM نشان داد، اما نشان داد که آنها در مرکز و در مرزهای SAM افزایش یافته‌اند (شکل 4e و شکل تکمیلی 9a,c). این نشان می‌دهد که GA نیز در SAM با الگوی مکانی قابل مقایسه با الگوی آشکار شده توسط qmRGA توزیع شده است. به عنوان یک رویکرد مکمل، ما همچنین SAM را با GA فلورسنت (GA3-، GA4-، GA7-Fl) یا Fl به تنهایی به عنوان کنترل منفی تیمار کردیم. سیگنال Fl در سراسر SAM، از جمله ناحیه مرکزی و پریموردیوم، البته با شدت کمتر توزیع شد (شکل 4j و شکل تکمیلی 10d). در مقابل، هر سه GA-Fl به طور خاص در مرزهای پریموردیوم و با درجات مختلف در بقیه IPR تجمع یافتند، به طوری که GA7-Fl در بزرگترین دامنه در IPR تجمع یافت (شکل 4k و شکل تکمیلی 10a، b). کمی‌سازی شدت فلورسانس نشان داد که نسبت شدت IPR به غیر IPR در SAM تیمار شده با GA-Fl در مقایسه با SAM تیمار شده با Fl بیشتر بود (شکل 4l و شکل تکمیلی 10c). این نتایج در مجموع نشان می‌دهد که GA در سلول‌های IPR که نزدیک‌تر به مرز اندام قرار دارند، در غلظت‌های بالاتر وجود دارد. این نشان می‌دهد که الگوی فعالیت سیگنالینگ GA در SAM ناشی از بیان متفاوت گیرنده‌های GA و تجمع متفاوت GA در سلول‌های IPR نزدیک مرزهای اندام است. بنابراین، تجزیه و تحلیل ما یک الگوی فضایی-زمانی غیرمنتظره از سیگنالینگ GA را نشان داد، با فعالیت کمتر در مرکز و پریموردیوم SAM و فعالیت بیشتر در IPR در ناحیه پیرامونی.
برای درک نقش فعالیت سیگنالینگ دیفرانسیلی GA در SAM، ما همبستگی بین فعالیت سیگنالینگ GA، گسترش سلولی و تقسیم سلولی را با استفاده از تصویربرداری زمان-گذر واقعی از SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS تجزیه و تحلیل کردیم. با توجه به نقش GA در تنظیم رشد، انتظار می‌رفت همبستگی مثبتی با پارامترهای گسترش سلولی وجود داشته باشد. بنابراین، ابتدا نقشه‌های فعالیت سیگنالینگ GA را با نقشه‌های سرعت رشد سطح سلول (به عنوان نماینده‌ای برای قدرت گسترش سلول برای یک سلول معین و برای سلول‌های دختر در زمان تقسیم) و با نقشه‌های ناهمسانگردی رشد، که جهت‌گیری گسترش سلول را اندازه‌گیری می‌کند (همچنین در اینجا برای یک سلول معین و برای سلول‌های دختر در زمان تقسیم استفاده می‌شود؛ شکل 5a، b، به روش‌ها و روش‌های تکمیلی مراجعه کنید) مقایسه کردیم. نقشه‌های ما از سرعت رشد سطح سلول SAM با مشاهدات قبلی 38،39 سازگار است، با حداقل سرعت رشد در مرز و حداکثر سرعت رشد در گل‌های در حال رشد (شکل 5a). تجزیه و تحلیل مؤلفه‌های اصلی (PCA) نشان داد که فعالیت سیگنالینگ GA با شدت رشد سطح سلول همبستگی منفی دارد (شکل 5c). ما همچنین نشان دادیم که محورهای اصلی تغییرات، شامل ورودی سیگنالینگ GA و شدت رشد، عمود بر جهت تعیین شده توسط بیان بالای CLV3 بودند، که حذف سلول‌ها از مرکز SAM را در تجزیه و تحلیل‌های باقی‌مانده تأیید می‌کند. تجزیه و تحلیل همبستگی اسپیرمن نتایج PCA را تأیید کرد (شکل 5d)، که نشان می‌دهد سیگنالینگ بالاتر GA در IPR منجر به گسترش بیشتر سلول نمی‌شود. با این حال، تجزیه و تحلیل همبستگی، همبستگی مثبت اندکی بین فعالیت سیگنالینگ GA و ناهمسانگردی رشد نشان داد (شکل 5c، d)، که نشان می‌دهد سیگنالینگ بالاتر GA در IPR بر جهت رشد سلول و احتمالاً موقعیت صفحه تقسیم سلولی تأثیر می‌گذارد.
الف، ب نقشه‌های حرارتی میانگین رشد سطحی (a) و ناهمسانگردی رشد (b) در SAM به طور میانگین در هفت گیاه مستقل (به ترتیب به عنوان نماینده‌هایی برای قدرت و جهت گسترش سلول استفاده شدند). ج تجزیه و تحلیل PCA شامل متغیرهای زیر بود: سیگنال GA، شدت رشد سطحی، ناهمسانگردی رشد سطحی و بیان CLV3. جزء 1 PCA عمدتاً با شدت رشد سطحی همبستگی منفی و با سیگنال GA همبستگی مثبت داشت. جزء 2 PCA عمدتاً با ناهمسانگردی رشد سطحی همبستگی مثبت و با بیان CLV3 همبستگی منفی داشت. درصدها نشان دهنده تغییرات توضیح داده شده توسط هر جزء هستند. د تجزیه و تحلیل همبستگی اسپیرمن بین سیگنال GA، شدت رشد سطحی و ناهمسانگردی رشد سطحی در مقیاس بافت به استثنای CZ. عدد سمت راست مقدار rho اسپیرمن بین دو متغیر است. ستاره‌ها مواردی را نشان می‌دهند که همبستگی/همبستگی منفی بسیار معنی‌دار است. ه تجسم سه‌بعدی سلول‌های Col-0 SAM L1 توسط میکروسکوپ کانفوکال. دیواره‌های سلولی جدید تشکیل‌شده در SAM (اما نه پریموردیوم) در ساعت 10 بر اساس مقادیر زاویه‌شان رنگ‌آمیزی می‌شوند. نوار رنگی در گوشه پایین سمت راست نشان داده شده است. تصویر داخل کادر، تصویر سه‌بعدی مربوطه را در ساعت 0 نشان می‌دهد. این آزمایش دو بار با نتایج مشابه تکرار شد. f نمودارهای جعبه‌ای، نرخ تقسیم سلولی را در SAM با IPR و غیر IPR Col-0 (n = 10 گیاه مستقل) نشان می‌دهند. خط مرکزی میانه را نشان می‌دهد و مرزهای جعبه، صدک‌های 25 و 75 را نشان می‌دهند. ریشک‌ها حداقل و حداکثر مقادیر تعیین‌شده با نرم‌افزار R را نشان می‌دهند. مقادیر P با آزمون t دوطرفه Welch به دست آمدند. g، h نمودار شماتیک نشان می‌دهد (g) نحوه اندازه‌گیری زاویه دیواره سلولی جدید (قرمز) نسبت به جهت شعاعی از مرکز SAM (خط نقطه‌چین سفید) (فقط مقادیر زاویه حاده، یعنی 0 تا 90 درجه، در نظر گرفته می‌شوند) و (h) جهت‌های محیطی/جانبی و شعاعی در مریستم. i نمودارهای فراوانی جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی به ترتیب در سراسر SAM (آبی تیره)، IPR (آبی متوسط) و غیر IPR (آبی روشن). مقادیر P با استفاده از آزمون دو دامنه‌ای کولموگروف-اسمیرنوف به دست آمدند. این آزمایش دو بار با نتایج مشابه تکرار شد. j نمودارهای فراوانی جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی IPR به ترتیب در اطراف P3 (سبز روشن)، P4 (سبز متوسط) و P5 (سبز تیره). مقادیر P با استفاده از آزمون دو دامنه‌ای کولموگروف-اسمیرنوف به دست آمدند. این آزمایش دو بار با نتایج مشابه تکرار شد.
بنابراین، در مرحله بعد، ما با شناسایی دیواره‌های سلولی تازه تشکیل شده در طول سنجش، همبستگی بین سیگنالینگ GA و فعالیت تقسیم سلولی را بررسی کردیم (شکل 5e). این رویکرد به ما امکان اندازه‌گیری فراوانی و جهت تقسیم سلولی را داد. با کمال تعجب، متوجه شدیم که فراوانی تقسیمات سلولی در IPR و بقیه SAM (غیر IPR، شکل 5f) مشابه بود، که نشان می‌دهد تفاوت در سیگنالینگ GA بین سلول‌های IPR و غیر IPR تأثیر قابل توجهی بر تقسیم سلولی ندارد. این موضوع، و همبستگی مثبت بین سیگنالینگ GA و ناهمسانگردی رشد، ما را بر آن داشت تا بررسی کنیم که آیا فعالیت سیگنالینگ GA می‌تواند بر جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی تأثیر بگذارد یا خیر. ما جهت‌گیری دیواره سلولی جدید را به صورت یک زاویه حاده نسبت به محور شعاعی متصل‌کننده مرکز مریستم و مرکز دیواره سلولی جدید اندازه‌گیری کردیم (شکل 5e-i) و تمایل واضحی را برای تقسیم سلول‌ها در زوایای نزدیک به 90 درجه نسبت به محور شعاعی مشاهده کردیم، با بالاترین فرکانس‌های مشاهده شده در 70-80 درجه (23.28٪) و 80-90 درجه (22.62٪) (شکل 5e،i)، که مربوط به تقسیمات سلولی در جهت محیطی/عرضی است (شکل 5h). برای بررسی سهم سیگنال‌دهی GA در این رفتار تقسیم سلولی، پارامترهای تقسیم سلولی را در IPR و غیر IPR به طور جداگانه تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 5i). ما مشاهده کردیم که توزیع زاویه تقسیم در سلول‌های IPR با سلول‌های غیر IPR یا در سلول‌های کل SAM متفاوت است، به طوری که سلول‌های IPR نسبت بالاتری از تقسیم‌های سلولی جانبی/حلقه‌ای را نشان می‌دهند، یعنی 70-80 درجه و 80-90 درجه (به ترتیب 33.86٪ و 30.71٪، نسبت‌های مربوطه) (شکل 5i). بنابراین، مشاهدات ما ارتباطی بین سیگنالینگ بالای GA و جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی نزدیک به جهت محیطی را نشان داد، مشابه همبستگی بین فعالیت سیگنالینگ GA و ناهمسانگردی رشد (شکل 5c، d). برای اثبات بیشتر حفاظت مکانی این ارتباط، جهت‌گیری صفحه تقسیم را در سلول‌های IPR اطراف پریموردیوم با شروع از P3 اندازه‌گیری کردیم، زیرا بالاترین فعالیت سیگنالینگ GA در این ناحیه با شروع از P4 شناسایی شد (شکل 4). زوایای تقسیم IPR در اطراف P3 و P4 هیچ تفاوت آماری معنی‌داری را نشان ندادند، اگرچه افزایش فراوانی تقسیمات سلولی جانبی در IPR در اطراف P4 مشاهده شد (شکل 5j). با این حال، در سلول‌های IPR در اطراف P5، تفاوت در جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی از نظر آماری معنی‌دار شد و افزایش شدیدی در فراوانی تقسیمات سلولی عرضی مشاهده شد (شکل 5j). در مجموع، این نتایج نشان می‌دهد که سیگنالینگ GA می‌تواند جهت‌گیری تقسیمات سلولی را در SAM کنترل کند، که با گزارش‌های قبلی40،41 مبنی بر اینکه سیگنالینگ بالای GA می‌تواند جهت‌گیری جانبی تقسیمات سلولی را در IPR القا کند، سازگار است.
پیش‌بینی می‌شود که سلول‌های موجود در IPR در پریموردیا ادغام نشوند، بلکه در میانگره‌ها قرار گیرند2،42،43. جهت‌گیری عرضی تقسیمات سلولی در IPR ممکن است منجر به سازماندهی معمول ردیف‌های طولی موازی سلول‌های اپیدرمی در میانگره‌ها شود. مشاهدات ما که در بالا توضیح داده شد، نشان می‌دهد که سیگنالینگ GA احتمالاً با تنظیم جهت تقسیم سلولی در این فرآیند نقش دارد.
از دست دادن عملکرد چندین ژن DELLA منجر به پاسخ GA ساختاری می‌شود و می‌توان از جهش‌یافته‌های della برای آزمایش این فرضیه استفاده کرد44. ما ابتدا الگوهای بیان پنج ژن DELLA را در SAM تجزیه و تحلیل کردیم. ادغام رونویسی خط GUS45 نشان داد که GAI، RGA، RGL1 و RGL2 (به میزان بسیار کمتری) در SAM بیان می‌شوند (شکل تکمیلی 11a-d). هیبریداسیون درجا همچنین نشان داد که mRNAی GAI به طور خاص در گل‌های اولیه و در حال رشد تجمع می‌یابد (شکل تکمیلی 11e). mRNAی RGL1 و RGL3 در سراسر تاج SAM و در گل‌های مسن‌تر شناسایی شدند، در حالی که mRNAی RGL2 در ناحیه مرزی فراوان‌تر بود (شکل تکمیلی 11f-h). تصویربرداری کانفوکال از pRGL3::RGL3-GFP SAM بیان مشاهده شده توسط هیبریداسیون درجا را تأیید کرد و نشان داد که پروتئین RGL3 در قسمت مرکزی SAM تجمع می‌یابد (شکل تکمیلی 11i). با استفاده از خط pRGA::GFP-RGA، ما همچنین دریافتیم که پروتئین RGA در SAM تجمع می‌یابد، اما فراوانی آن در مرز با شروع از P4 کاهش می‌یابد (شکل تکمیلی 11j). نکته قابل توجه این است که الگوهای بیان RGL3 و RGA با فعالیت سیگنالینگ بالاتر GA در IPR سازگار هستند، همانطور که توسط qmRGA شناسایی شده است (شکل 4). علاوه بر این، این داده‌ها نشان می‌دهد که همه DELLAها در SAM بیان می‌شوند و بیان آنها به طور جمعی کل SAM را در بر می‌گیرد.
در مرحله بعد، پارامترهای تقسیم سلولی را در SAM نوع وحشی (Ler، کنترل) و جهش‌یافته‌های پنج‌تایی della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 (سراسری) تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 6a، b). جالب توجه است که ما یک تغییر آماری معنی‌دار در توزیع فرکانس‌های زاویه تقسیم سلولی در SAM جهش‌یافته della global در مقایسه با نوع وحشی مشاهده کردیم (شکل 6c). این تغییر در جهش‌یافته della global به دلیل افزایش فرکانس زوایای 80-90 درجه (34.71٪ در مقابل 24.55٪) و به میزان کمتر، زوایای 70-80 درجه (23.78٪ در مقابل 20.18٪) بود، یعنی مربوط به تقسیمات سلولی عرضی (شکل 6c). فرکانس تقسیمات غیرعرضی (0-60 درجه) نیز در جهش‌یافته della global کمتر بود (شکل 6c). فراوانی تقسیمات سلولی عرضی در SAM جهش‌یافته‌ی della global به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 6b). فراوانی تقسیمات سلولی عرضی در IPR نیز در جهش‌یافته‌ی della global در مقایسه با نوع وحشی بیشتر بود (شکل 6d). در خارج از ناحیه‌ی IPR، نوع وحشی توزیع یکنواخت‌تری از زوایای تقسیم سلولی داشت، در حالی که جهش‌یافته‌ی della global تقسیمات مماسی مانند IPR را ترجیح می‌داد (شکل 6e). ما همچنین جهت‌گیری تقسیمات سلولی را در SAM جهش‌یافته‌های پنج‌تایی ga2 اکسیداز (ga2ox) (ga2ox1-1، ga2ox2-1، ga2ox3-1، ga2ox4-1 و ga2ox6-2)، یک پس‌زمینه‌ی جهش‌یافته‌ی غیرفعال GA که GA در آن تجمع می‌یابد، کمّی‌سازی کردیم. مطابق با افزایش سطح GA، SAM گل‌آذین جهش‌یافته‌ی پنج‌تایی ga2ox بزرگتر از Col-0 بود (شکل‌های تکمیلی 12a، b) و در مقایسه با Col-0، SAM پنج‌تایی ga2ox توزیع کاملاً متفاوتی از زوایای تقسیم سلولی را نشان داد، به طوری که فرکانس زاویه از 50 درجه به 90 درجه افزایش یافت، یعنی دوباره به نفع تقسیم‌های مماسی (شکل‌های تکمیلی 12a-c). بنابراین، ما نشان می‌دهیم که فعال‌سازی دائمی سیگنال‌دهی GA و تجمع GA باعث تقسیم‌های سلولی جانبی در IPR و بقیه‌ی SAM می‌شود.
الف، ب تجسم سه‌بعدی لایه L1 از Ler رنگ‌آمیزی‌شده با PI (الف) و جهش‌یافته سراسری della (ب) SAM با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال. دیواره‌های سلولی جدید تشکیل‌شده در SAM (اما نه پریموردیوم) طی یک دوره 10 ساعته نشان داده شده و بر اساس مقادیر زاویه آنها رنگ‌آمیزی شده‌اند. تصویر داخلی، SAM را در ساعت 0 نشان می‌دهد. نوار رنگی در گوشه پایین سمت راست نمایش داده شده است. فلش در (ب) به نمونه‌ای از فایل‌های سلولی هم‌تراز در جهش‌یافته سراسری della اشاره دارد. این آزمایش دو بار با نتایج مشابه تکرار شد. ce مقایسه توزیع فراوانی جهت‌گیری‌های صفحه تقسیم سلولی در کل SAM (د)، IPR (ه) و غیر IPR (ف) بین Ler و della سراسری. مقادیر P با استفاده از آزمون دو طرفه کولموگروف-اسمیرنوف به دست آمد. f، g تجسم سه‌بعدی تصاویر کانفوکال از SAM رنگ‌آمیزی‌شده با PI از گیاهان تراریخته Col-0 (i) و pCUC2::gai-1-VENUS (ج). پانل‌های (a، b) دیواره‌های سلولی جدید (اما نه پریموردیا) را نشان می‌دهند که در SAM ظرف 10 ساعت تشکیل شده‌اند. این آزمایش دو بار با نتایج مشابه تکرار شد. h-j مقایسه توزیع فراوانی جهت‌گیری‌های صفحه تقسیم سلولی واقع در کل SAM (h)، IPR (i) و غیر IPR (j) بین گیاهان Col-0 و pCUC2::gai-1-VENUS. مقادیر P با استفاده از آزمون دو طرفه کولموگروف-اسمیرنوف بدست آمدند.
در مرحله بعد، اثر مهار سیگنالینگ GA را به طور خاص در IPR آزمایش کردیم. برای این منظور، از پروموتر کاپ لپه ۲ (CUC2) برای هدایت بیان یک پروتئین غالب منفی gai-1 متصل به VENUS (در رده pCUC2::gai-1-VENUS) استفاده کردیم. در SAM نوع وحشی، پروموتر CUC2 بیان اکثر IPRها را در SAM، از جمله سلول‌های مرزی، از P4 به بعد هدایت می‌کند و بیان خاص مشابهی در گیاهان pCUC2::gai-1-VENUS مشاهده شد (به زیر مراجعه کنید). توزیع زوایای تقسیم سلولی در سراسر SAM یا IPR گیاهان pCUC2::gai-1-VENUS تفاوت معنی‌داری با نوع وحشی نداشت، اگرچه به طور غیرمنتظره‌ای متوجه شدیم که سلول‌های بدون IPR در این گیاهان با فرکانس بالاتری از ۸۰ تا ۹۰ درجه تقسیم می‌شوند (شکل ۶f-j).
پیشنهاد شده است که جهت تقسیم سلولی به هندسه SAM، به ویژه تنش کششی ایجاد شده توسط انحنای بافت، بستگی دارد46. بنابراین، ما این سوال را مطرح کردیم که آیا شکل SAM در گیاهان جهش‌یافته della global و pCUC2::gai-1-VENUS تغییر کرده است یا خیر. همانطور که قبلاً گزارش شده است12، اندازه SAM جهش‌یافته della global بزرگتر از نوع وحشی بود (شکل تکمیلی 13a، b، d). هیبریداسیون درجا CLV3 و STM RNA گسترش مریستم در جهش‌یافته‌های della را تأیید کرد و گسترش جانبی جایگاه سلول‌های بنیادی را نیز نشان داد (شکل تکمیلی 13e، f، h، i). با این حال، انحنای SAM در هر دو ژنوتیپ مشابه بود (شکل تکمیلی 13k، m، n، p). ما افزایش مشابهی در اندازه را در جهش چهارگانه della مربوط به gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 بدون تغییر در انحنا در مقایسه با نوع وحشی مشاهده کردیم (شکل‌های تکمیلی 13c، d، g، j، l، o، p). فراوانی جهت‌گیری تقسیم سلولی نیز در جهش چهارگانه della تحت تأثیر قرار گرفت، اما به میزان کمتری نسبت به جهش یکپارچه della (شکل‌های تکمیلی 12d-f). این اثر دوز، همراه با عدم تأثیر بر انحنا، نشان می‌دهد که فعالیت RGL3 باقیمانده در جهش چهارگانه Della، تغییرات در جهت‌گیری تقسیم سلولی ناشی از از دست دادن فعالیت DELLA را محدود می‌کند و تغییرات در تقسیمات سلولی جانبی در پاسخ به تغییرات در فعالیت سیگنالینگ GA رخ می‌دهد تا تغییرات در هندسه SAM. همانطور که در بالا توضیح داده شد، پروموتر CUC2 بیان IPR را در SAM از P4 شروع می‌کند (شکل‌های تکمیلی 14a، b) و در مقابل، pCUC2::gai-1-VENUS SAM اندازه کوچکتری داشت اما انحنای بیشتری داشت (شکل‌های تکمیلی 14c-h). این تغییر در مورفولوژی pCUC2::gai-1-VENUS SAM ممکن است منجر به توزیع متفاوتی از تنش‌های مکانیکی در مقایسه با نوع وحشی شود، که در آن تنش‌های محیطی بالا در فاصله کمتری از مرکز SAM شروع می‌شوند47. از طرف دیگر، تغییرات در مورفولوژی pCUC2::gai-1-VENUS SAM ممکن است ناشی از تغییرات در خواص مکانیکی منطقه‌ای ناشی از بیان ترانسژن باشد48. در هر دو مورد، این می‌تواند تا حدی اثرات تغییرات در سیگنالینگ GA را با افزایش احتمال تقسیم سلول‌ها در جهت محیطی/عرضی جبران کند، که مشاهدات ما را توضیح می‌دهد.
روی هم رفته، داده‌های ما تأیید می‌کنند که سیگنال‌دهی بالاتر GA نقش فعالی در جهت‌گیری جانبی صفحه تقسیم سلولی در IPR ایفا می‌کند. آن‌ها همچنین نشان می‌دهند که انحنای مریستم نیز بر جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی در IPR تأثیر می‌گذارد.
جهت‌گیری عرضی صفحه تقسیم در IPR، به دلیل فعالیت بالای سیگنال‌دهی GA، نشان می‌دهد که GA یک فایل سلولی شعاعی را در اپیدرم درون SAM از پیش سازماندهی می‌کند تا سازماندهی سلولی را که بعداً در میانگره اپیدرمی یافت می‌شود، تعریف کند. در واقع، چنین فایل‌های سلولی اغلب در تصاویر SAM از جهش‌یافته‌های della global قابل مشاهده بودند (شکل 6b). بنابراین، برای بررسی بیشتر عملکرد رشدی الگوی مکانی سیگنال‌دهی GA در SAM، ما از تصویربرداری مرور زمان برای تجزیه و تحلیل سازماندهی مکانی سلول‌ها در IPR در گیاهان وحشی (Ler و Col-0)، جهش‌یافته‌های della global و گیاهان تراریخته pCUC2::gai-1-VENUS استفاده کردیم.
ما دریافتیم که qmRGA نشان می‌دهد که فعالیت سیگنالینگ GA در IPR از P1/P2 افزایش یافته و در P4 به اوج خود می‌رسد و این الگو در طول زمان ثابت می‌ماند (شکل 4a-f و شکل تکمیلی 8c-f، k). برای تجزیه و تحلیل سازماندهی فضایی سلول‌ها در IPR با افزایش سیگنال GA، سلول‌های Ler IPR را در بالا و کناره‌های P4 بر اساس سرنوشت تکاملی آنها که 34 ساعت پس از اولین مشاهده، یعنی بیش از دو بار پلاستید، تجزیه و تحلیل شده بود، برچسب‌گذاری کردیم که به ما امکان می‌دهد سلول‌های IPR را در طول تکامل پریموردیوم از P1/P2 تا P4 دنبال کنیم. ما از سه رنگ مختلف استفاده کردیم: زرد برای سلول‌هایی که در پریموردیوم نزدیک P4 ادغام شده بودند، سبز برای سلول‌هایی که در IPR بودند و بنفش برای سلول‌هایی که در هر دو فرآیند شرکت داشتند (شکل 7a-c). در t0 (0 ساعت)، 1-2 لایه از سلول‌های IPR در جلوی P4 قابل مشاهده بودند (شکل 7a). همانطور که انتظار می‌رفت، وقتی این سلول‌ها تقسیم شدند، این کار را عمدتاً از طریق صفحه تقسیم عرضی انجام دادند (شکل‌های 7a-c). نتایج مشابهی با استفاده از Col-0 SAM (با تمرکز بر P3 که چین‌های مرزی آن مشابه P4 در Ler است) به دست آمد، اگرچه در این ژنوتیپ، چین تشکیل شده در حاشیه گل، سلول‌های IPR را سریع‌تر پنهان کرد (شکل 7g-i). بنابراین، الگوی تقسیم سلول‌های IPR، سلول‌ها را مانند میانگره‌ها، به صورت ردیف‌های شعاعی از پیش سازماندهی می‌کند. سازماندهی ردیف‌های شعاعی و قرارگیری سلول‌های IPR بین اندام‌های متوالی نشان می‌دهد که این سلول‌ها، پیش‌سازهای میانگره‌ای هستند.
در اینجا، ما یک حسگر زیستی سیگنال‌دهی GA با نسبت‌سنجی، به نام qmRGA، توسعه دادیم که امکان نقشه‌برداری کمی از فعالیت سیگنال‌دهی GA حاصل از غلظت‌های ترکیبی GA و گیرنده GA را فراهم می‌کند و در عین حال تداخل با مسیرهای سیگنال‌دهی درون‌زا را به حداقل می‌رساند و در نتیجه اطلاعاتی در مورد عملکرد GA در سطح سلولی ارائه می‌دهد. برای این منظور، ما یک پروتئین DELLA اصلاح‌شده، به نام mRGA، ساختیم که توانایی اتصال به شرکای برهمکنش DELLA را از دست داده است، اما همچنان به پروتئولیز ناشی از GA حساس است. qmRGA به تغییرات برون‌زا و درون‌زا در سطوح GA پاسخ می‌دهد و خواص حسگری پویای آن، ارزیابی تغییرات مکانی-زمانی در فعالیت سیگنال‌دهی GA را در طول توسعه امکان‌پذیر می‌سازد. qmRGA همچنین ابزاری بسیار انعطاف‌پذیر است زیرا می‌تواند با تغییر پروموتر مورد استفاده برای بیان آن (در صورت لزوم) با بافت‌های مختلف سازگار شود و با توجه به ماهیت حفاظت‌شده مسیر سیگنال‌دهی GA و موتیف PFYRE در نهاندانگان، احتمالاً قابل انتقال به گونه‌های دیگر است22. مطابق با این، یک جهش معادل در پروتئین SLR1 DELLA برنج (HYY497AAA) نیز نشان داده شده است که فعالیت سرکوبگر رشد SLR1 را سرکوب می‌کند در حالی که تخریب ناشی از GA آن را تنها اندکی کاهش می‌دهد، مشابه mRGA23. قابل توجه است که مطالعات اخیر در Arabidopsis نشان داد که یک جهش اسید آمینه در دامنه PFYRE (S474L) فعالیت رونویسی RGA را بدون تأثیر بر توانایی آن در تعامل با شرکای فاکتور رونویسی تغییر داده است50. اگرچه این جهش بسیار نزدیک به 3 جایگزینی اسید آمینه موجود در mRGA است، مطالعات ما نشان می‌دهد که این دو جهش ویژگی‌های متمایز DELLA را تغییر می‌دهند. اگرچه بیشتر شرکای فاکتور رونویسی به دامنه‌های LHR1 و SAW از DELLA26،51 متصل می‌شوند، برخی از اسیدهای آمینه حفاظت شده در دامنه PFYRE ممکن است به تثبیت این تعاملات کمک کنند.
توسعه میانگره یک ویژگی کلیدی در معماری گیاه و بهبود عملکرد است. qmRGA فعالیت سیگنالینگ GA بالاتری را در سلول‌های پیش‌ساز میانگره IPR نشان داد. با ترکیب تصویربرداری کمی و ژنتیک، نشان دادیم که الگوهای سیگنالینگ GA، صفحات تقسیم سلولی دایره‌ای/عرضی را در اپیدرم SAM روی هم قرار می‌دهند و سازماندهی تقسیم سلولی مورد نیاز برای توسعه میانگره را شکل می‌دهند. چندین تنظیم‌کننده جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی در طول توسعه شناسایی شده‌اند52،53. کار ما نمونه روشنی از چگونگی تنظیم این پارامتر سلولی توسط فعالیت سیگنالینگ GA ارائه می‌دهد. DELLA می‌تواند با کمپلکس‌های پروتئینی پیش تاخورده41 تعامل داشته باشد، بنابراین سیگنالینگ GA ممکن است با تأثیر مستقیم بر جهت‌گیری میکروتوبول‌های قشری، جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی را تنظیم کند40،41،54،55. ما به طور غیرمنتظره‌ای نشان دادیم که در SAM، همبستگی فعالیت سیگنالینگ GA بالاتر، طویل شدن یا تقسیم سلولی نبود، بلکه فقط ناهمسانگردی رشد بود که با تأثیر مستقیم GA بر جهت تقسیم سلولی در IPR سازگار است. با این حال، نمی‌توانیم این احتمال را رد کنیم که این اثر می‌تواند غیرمستقیم نیز باشد، به عنوان مثال توسط نرم شدن دیواره سلولی ناشی از GA56. تغییرات در خواص دیواره سلولی باعث ایجاد استرس مکانیکی می‌شود57،58، که می‌تواند با تأثیر بر جهت‌گیری میکروتوبول‌های قشری، بر جهت‌گیری صفحه تقسیم سلولی نیز تأثیر بگذارد39،46،59. اثرات ترکیبی استرس مکانیکی ناشی از GA و تنظیم مستقیم جهت‌گیری میکروتوبول‌ها توسط GA ممکن است در ایجاد الگوی خاصی از جهت‌گیری تقسیم سلولی در IPR برای تعریف میانگره‌ها نقش داشته باشد و مطالعات بیشتری برای آزمایش این ایده مورد نیاز است. به طور مشابه، مطالعات قبلی اهمیت پروتئین‌های متقابل DELLA یعنی TCP14 و 15 را در کنترل تشکیل میانگره‌ها برجسته کرده‌اند60،61 و این عوامل ممکن است واسطه عمل GA به همراه BREVIPEDICELLUS (BP) و PENNYWISE (PNY) باشند که توسعه میانگره‌ها را تنظیم می‌کنند و نشان داده شده است که بر سیگنال‌دهی GA تأثیر می‌گذارند2،62. با توجه به اینکه DELLAها با مسیرهای سیگنالینگ براسینواستروئید، اتیلن، اسید جاسمونیک و اسید آبسیزیک (ABA) تعامل دارند63،64 و اینکه این هورمون‌ها می‌توانند بر جهت‌گیری میکروتوبول‌ها تأثیر بگذارند65، اثرات GA بر جهت‌گیری تقسیم سلولی ممکن است توسط هورمون‌های دیگر نیز واسطه‌گری شود.
مطالعات اولیه سیتولوژیکی نشان داد که هر دو ناحیه داخلی و خارجی SAM در گیاه Arabidopsis برای توسعه میانگره‌ها مورد نیاز هستند2،42. این واقعیت که GA به طور فعال تقسیم سلولی را در بافت‌های داخلی تنظیم می‌کند12، از عملکرد دوگانه GA در تنظیم اندازه مریستم و میانگره در SAM پشتیبانی می‌کند. الگوی تقسیم سلولی جهت‌دار نیز در بافت SAM داخلی به شدت تنظیم می‌شود و این تنظیم برای رشد ساقه ضروری است52. بررسی اینکه آیا GA در جهت‌دهی صفحه تقسیم سلولی در سازمان SAM داخلی نیز نقش دارد، و در نتیجه مشخصات و توسعه میانگره‌ها را در SAM هماهنگ می‌کند، جالب خواهد بود.
گیاهان به صورت آزمایشگاهی در خاک یا محیط کشت موراشیگ-اسکوگ (MS) (دوچفا) حاوی ۱٪ ساکارز و ۱٪ آگار (سیگما) تحت شرایط استاندارد (۱۶ ساعت نور، ۲۲ درجه سانتیگراد) کشت داده شدند، به جز آزمایش‌های رشد هیپوکوتیل و ریشه که در آنها نهال‌ها روی صفحات عمودی تحت نور ثابت و ۲۲ درجه سانتیگراد کشت داده شدند. برای آزمایش‌های نیترات، گیاهان در محیط کشت MS اصلاح‌شده (محیط کشت گیاهی bioWORLD) حاوی نیترات کافی (۰ یا ۱۰ میلی‌مولار KNO3)، ۰.۵ میلی‌مولار NH4-سوکسینات، ۱٪ ساکارز و ۱٪ A-آگار (سیگما) تحت شرایط روز بلند کشت داده شدند.
cDNA مربوط به GID1a که در pDONR221 قرار داده شده بود، با pDONR P4-P1R-pUBQ10 و pDONR P2R-P3-mCherry در pB7m34GW نوترکیب شد تا pUBQ10::GID1a-mCherry تولید شود. DNA مربوط به IDD2 که در pDONR221 قرار داده شده بود، در pB7RWG266 نوترکیب شد تا p35S:IDD2-RFP تولید شود. برای تولید pGID1b::2xmTQ2-GID1b، ابتدا یک قطعه 3.9 کیلوبایتی در بالادست ناحیه کدکننده GID1b و یک قطعه 4.7 کیلوبایتی حاوی cDNA GID1b (1.3 کیلوبایت) و قطعه پایان‌دهنده (3.4 کیلوبایت) با استفاده از آغازگرهای جدول تکمیلی 3 تکثیر و سپس به ترتیب در pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) و pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) قرار داده شدند و در نهایت با استفاده از شبیه‌سازی Gateway با pDONR221 2xmTQ268 در ناقل هدف pGreen 012567 نوترکیب شدند. برای تولید pCUC2::LSSmOrange، توالی پروموتر CUC2 (3229 جفت باز در بالادست ATG) و به دنبال آن توالی کدکننده mOrange بزرگ تغییر یافته با استوکس (LSSmOrange)69 با سیگنال محلی‌سازی هسته‌ای N7 و پایان‌دهنده رونویسی NOS با استفاده از سیستم نوترکیبی Gateway 3-fragment (Invitrogen) در ناقل هدف‌گیری کانامایسین pGreen مونتاژ شدند. ناقل دوتایی گیاهی به Agrobacterium tumefaciens سویه GV3101 وارد شد و به ترتیب با روش نفوذ Agrobacterium به برگ‌های Nicotiana benthamiana و با روش غوطه‌وری گل به Arabidopsis thaliana Col-0 وارد شد. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry و pCLV3::mCherry-NLS qmRGA به ترتیب از نتاج F3 و F1 تلاقی‌های مربوطه جدا شدند.
هیبریداسیون RNA درجا روی نوک شاخه‌هایی به طول تقریباً 1 سانتی‌متر انجام شد72 که جمع‌آوری و بلافاصله در محلول FAA (3.7٪ فرمالدئید، 5٪ اسید استیک، 50٪ اتانول) که از قبل تا 4 درجه سانتیگراد سرد شده بود، تثبیت شدند. پس از 2 × 15 دقیقه تیمار خلاء، ماده تثبیت‌کننده تغییر کرد و نمونه‌ها به مدت یک شب انکوبه شدند. cDNA های GID1a، GID1b، GID1c، GAI، RGL1، RGL2 و RGL3 و پروب‌های آنتی‌سنس برای 3'-UTR های آنها با استفاده از پرایمرهای نشان داده شده در جدول تکمیلی 3 همانطور که توسط Rosier و همکاران شرح داده شده است، سنتز شدند73. پروب‌های نشاندار شده با دیگوکسیژنین با استفاده از آنتی‌بادی‌های دیگوکسیژنین (رقت ۳۰۰۰ برابر؛ Roche، شماره کاتالوگ: ۱۱ ۰۹۳ ۲۷۴ ۹۱۰) به روش ایمونودتکتیو شناسایی شدند و برش‌ها با محلول ۵-برومو-۴-کلرو-۳-ایندولیل فسفات (BCIP، رقت ۲۵۰ برابر)/نیتروبلو تترازولیوم (NBT، رقت ۲۰۰ برابر) رنگ‌آمیزی شدند.