در این مطالعه، اثرات تحریکی درمان ترکیبیتنظیمکنندههای رشد گیاهی(2,4-D و کینتین) و نانوذرات اکسید آهن (Fe₃O₄-NPs) بر ریختزایی درون شیشهای و تولید متابولیت ثانویه در گیاه گل راعی (Hypericum perforatum* L.) بررسی شدند. تیمار بهینه [2,4-D (0.5 میلیگرم در لیتر) + کینتین (2 میلیگرم در لیتر) + Fe₃O₄-NPs (4 میلیگرم در لیتر)] پارامترهای رشد گیاه را به طور قابل توجهی بهبود بخشید: ارتفاع گیاه 59.6٪، طول ریشه 114.0٪، تعداد جوانه 180.0٪ و وزن تر کالوس 198.3٪ در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت. این تیمار ترکیبی همچنین راندمان باززایی (50.85٪) را افزایش داد و محتوای هیپریسین را 66.6٪ افزایش داد. تجزیه و تحلیل GC-MS محتوای بالای هیپروزید، بتا-پاتولن و ستیل الکل را نشان داد که ۹۳.۳۶٪ از کل مساحت پیک را تشکیل میدهند، در حالی که محتوای فنولیکها و فلاونوئیدهای کل تا ۸۰.۱٪ افزایش یافته است. این نتایج نشان میدهد که تنظیمکنندههای رشد گیاهی (PGRs) و نانوذرات Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) با تحریک اندامزایی و تجمع ترکیبات زیستفعال، اثر همافزایی دارند که نشاندهنده یک استراتژی امیدوارکننده برای بهبود بیوتکنولوژیکی گیاهان دارویی است.
علف چای (Hypericum perforatum L.)، که با نام علف چای نیز شناخته میشود، گیاهی علفی و چند ساله از خانواده Hypericaceae است که ارزش اقتصادی دارد.[1] اجزای فعال زیستی بالقوه آن شامل تاننهای طبیعی، زانتونها، فلوروگلوسینول، نفتالن دی آنترون (هیپرین و سودوهیپرین)، فلاونوئیدها، اسیدهای فنلی و روغنهای ضروری است.[2،3،4] علف چای را میتوان با روشهای سنتی تکثیر کرد. با این حال، فصلی بودن روشهای سنتی، جوانهزنی کم بذر و حساسیت به بیماریها، پتانسیل آن را برای کشت در مقیاس بزرگ و تشکیل مداوم متابولیتهای ثانویه محدود میکند.[1،5،6]
بنابراین، کشت بافت درون شیشهای روشی مؤثر برای تکثیر سریع گیاه، حفظ منابع ژرمپلاسم و افزایش عملکرد ترکیبات دارویی در نظر گرفته میشود [7، 8]. تنظیمکنندههای رشد گیاهی (PGRs) نقش مهمی در تنظیم ریختزایی دارند و برای کشت درون شیشهای کالوس و موجودات کامل ضروری هستند. بهینهسازی غلظت و ترکیب آنها برای تکمیل موفقیتآمیز این فرآیندهای رشدی بسیار مهم است [9]. بنابراین، درک ترکیب و غلظت مناسب تنظیمکنندهها برای بهبود رشد و ظرفیت باززایی علف چای (H. perforatum) مهم است [10].
نانوذرات اکسید آهن (Fe₃O₄) دستهای از نانوذرات هستند که برای کشت بافت توسعه یافتهاند یا در حال توسعه هستند. Fe₃O₄ دارای خواص مغناطیسی قابل توجه، زیستسازگاری خوب و توانایی افزایش رشد گیاه و کاهش استرس محیطی است، بنابراین توجه قابل توجهی را در طرحهای کشت بافت به خود جلب کرده است. کاربردهای بالقوه این نانوذرات ممکن است شامل بهینهسازی کشت درون شیشهای برای افزایش تقسیم سلولی، بهبود جذب مواد مغذی و فعال کردن آنزیمهای آنتیاکسیدان باشد [11].
اگرچه نانوذرات اثرات خوبی بر رشد گیاه نشان دادهاند، اما مطالعات در مورد کاربرد ترکیبی نانوذرات Fe₃O₄ و تنظیمکنندههای رشد گیاهی بهینهشده در *H. perforatum* همچنان کمیاب است. برای پر کردن این شکاف دانش، این مطالعه اثرات اثرات ترکیبی آنها را بر ریختزایی درون شیشهای و تولید متابولیتهای ثانویه ارزیابی کرد تا بینشهای جدیدی برای بهبود ویژگیهای گیاهان دارویی ارائه دهد. بنابراین، این مطالعه دو هدف دارد: (1) بهینهسازی غلظت تنظیمکنندههای رشد گیاهی برای ترویج مؤثر تشکیل کالوس، باززایی شاخه و ریشهزایی در شرایط آزمایشگاهی؛ و (2) ارزیابی اثرات نانوذرات Fe₃O₄ بر پارامترهای رشد در شرایط آزمایشگاهی. برنامههای آینده شامل ارزیابی میزان بقای گیاهان باززایی شده در طول سازگاری (در شرایط آزمایشگاهی) است. انتظار میرود نتایج این مطالعه به طور قابل توجهی راندمان ریزازدیادی *H. perforatum* را بهبود بخشد و در نتیجه به استفاده پایدار و کاربردهای بیوتکنولوژیکی این گیاه دارویی مهم کمک کند.
در این مطالعه، ما ریزنمونههای برگ را از گیاهان یک ساله گل راعی (گیاهان مادری) که در مزرعه کشت شده بودند، تهیه کردیم. این ریزنمونهها برای بهینهسازی شرایط کشت درون شیشهای استفاده شدند. قبل از کشت، برگها به مدت چند دقیقه زیر آب مقطر جاری کاملاً شسته شدند. سپس سطوح ریزنمونه با غوطهوری در اتانول 70٪ به مدت 30 ثانیه ضدعفونی شدند و پس از آن به مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 1.5٪ (NaOCl) حاوی چند قطره Tween 20 غوطهوری شدند. در نهایت، ریزنمونهها قبل از انتقال به محیط کشت بعدی، سه بار با آب مقطر استریل شسته شدند.
طی چهار هفتهی بعد، پارامترهای باززایی شاخه، از جمله سرعت باززایی، تعداد شاخه در هر ریزنمونه و طول شاخه، اندازهگیری شدند. هنگامی که شاخههای باززایی شده به طول حداقل ۲ سانتیمتر رسیدند، به محیط ریشهزایی متشکل از محیط کشت MS با غلظت نصف، ۰.۵ میلیگرم در لیتر ایندول بوتیریک اسید (IBA) و ۰.۳٪ صمغ گوار منتقل شدند. کشت ریشهزایی به مدت سه هفته ادامه یافت و در این مدت سرعت ریشهزایی، تعداد ریشه و طول ریشه اندازهگیری شد. هر تیمار سه بار تکرار شد و در هر تکرار ۱۰ ریزنمونه کشت داده شد که تقریباً ۳۰ ریزنمونه در هر تیمار به دست آمد.
ارتفاع گیاه با استفاده از خطکش، از پایه گیاه تا نوک بلندترین برگ، بر حسب سانتیمتر (cm) اندازهگیری شد. طول ریشه بلافاصله پس از برداشتن دقیق نهالها و برداشتن محیط کشت، بر حسب میلیمتر (mm) اندازهگیری شد. تعداد جوانهها در هر ریزنمونه مستقیماً روی هر گیاه شمارش شد. تعداد لکههای سیاه روی برگها، که به عنوان گره شناخته میشوند، به صورت بصری اندازهگیری شد. اعتقاد بر این است که این گرههای سیاه، غدههای حاوی هیپریسین یا لکههای اکسیداتیو هستند و به عنوان یک شاخص فیزیولوژیکی از پاسخ گیاه به درمان استفاده میشوند. پس از برداشتن تمام محیط کشت، وزن تازه نهالها با استفاده از یک ترازوی الکترونیکی با دقت میلیگرم (mg) اندازهگیری شد.
روش محاسبه سرعت تشکیل کالوس به شرح زیر است: پس از کشت ریزنمونهها در محیطی حاوی تنظیمکنندههای رشد مختلف (کینازها، 2,4-D و Fe3O4) به مدت چهار هفته، تعداد ریزنمونههایی که قادر به تشکیل کالوس هستند شمارش میشود. فرمول محاسبه سرعت تشکیل کالوس به شرح زیر است:
هر تیمار سه بار تکرار شد و در هر تکرار حداقل 10 ریزنمونه مورد بررسی قرار گرفت.
نرخ باززایی، نشان دهنده نسبت بافت کالوس است که پس از مرحله تشکیل کالوس، فرآیند تمایز جوانه را با موفقیت به پایان میرساند. این شاخص، توانایی بافت کالوس را برای تبدیل به بافت تمایز یافته و رشد به اندامهای جدید گیاهی نشان میدهد.
ضریب ریشهزایی، نسبت تعداد شاخههای قادر به ریشهزایی به تعداد کل شاخهها است. این شاخص، موفقیت مرحله ریشهزایی را نشان میدهد که در ریزازدیادی و تکثیر گیاهان بسیار مهم است، زیرا ریشهزایی خوب به نهالها کمک میکند تا در شرایط رشد بهتر زنده بمانند.
ترکیبات هایپریسین با متانول 90% استخراج شدند. پنجاه میلیگرم از ماده گیاهی خشک به 1 میلیلیتر متانول اضافه شد و به مدت 20 دقیقه با فرکانس 30 کیلوهرتز در دستگاه پاککننده اولتراسونیک (مدل A5120-3YJ) در دمای اتاق و تاریکی تحت امواج فراصوت قرار گرفت. پس از فراصوت، نمونه به مدت 15 دقیقه با سرعت 6000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی جمعآوری شد و جذب هایپریسین در طول موج 592 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر Plus-3000 S طبق روش شرح داده شده توسط Conceiçao و همکاران [14] اندازهگیری شد.
بیشتر تیمارها با تنظیمکنندههای رشد گیاهی (PGR) و نانوذرات اکسید آهن (Fe₃O₄-NPs) باعث تشکیل گره سیاه در برگهای شاخههای باززایی شده نشدند. در هیچ یک از تیمارها با 0.5 یا 1 میلیگرم در لیتر 2,4-D، 0.5 یا 1 میلیگرم در لیتر کینتین، یا 1، 2 یا 4 میلیگرم در لیتر نانوذرات اکسید آهن، هیچ گرهای مشاهده نشد. چند ترکیب، افزایش اندکی در توسعه گره (اما نه از نظر آماری معنیدار) در غلظتهای بالاتر کینتین و/یا نانوذرات اکسید آهن، مانند ترکیب 2,4-D (0.5-2 میلیگرم در لیتر) با کینتین (1-1.5 میلیگرم در لیتر) و نانوذرات اکسید آهن (2-4 میلیگرم در لیتر) نشان دادند. این نتایج در شکل 2 نشان داده شده است. گرههای سیاه نشاندهنده غدد غنی از هیپریسین هستند که هم به طور طبیعی وجود دارند و هم مفید هستند. در این مطالعه، گرههای سیاه عمدتاً با قهوهای شدن بافتها مرتبط بودند که نشان دهنده محیط مساعدی برای تجمع هیپریسین است. تیمار با نانوذرات 2،4-D، کینتین و Fe₃O₄ باعث افزایش رشد کالوس، کاهش قهوهای شدن و افزایش محتوای کلروفیل شد که نشاندهنده بهبود عملکرد متابولیک و کاهش بالقوه آسیب اکسیداتیو است [37]. این مطالعه اثرات کینتین را در ترکیب با نانوذرات 2،4-D و Fe₃O₄ بر رشد و نمو کالوس گل راعی (شکل 3a-g) ارزیابی کرد. مطالعات قبلی نشان دادهاند که نانوذرات Fe₃O₄ دارای فعالیتهای ضد قارچی و ضد میکروبی هستند [38، 39] و هنگامی که در ترکیب با تنظیمکنندههای رشد گیاه استفاده میشوند، میتوانند مکانیسمهای دفاعی گیاه را تحریک کرده و شاخصهای استرس سلولی را کاهش دهند [18]. اگرچه بیوسنتز متابولیتهای ثانویه از نظر ژنتیکی تنظیم میشود، اما عملکرد واقعی آنها به شدت به شرایط محیطی وابسته است. تغییرات متابولیکی و مورفولوژیکی میتوانند با تنظیم بیان ژنهای خاص گیاه و پاسخ به عوامل محیطی، بر سطح متابولیتهای ثانویه تأثیر بگذارند. علاوه بر این، القاکنندهها میتوانند فعالسازی ژنهای جدید را تحریک کنند که به نوبه خود فعالیت آنزیمی را تحریک میکنند و در نهایت مسیرهای بیوسنتزی متعددی را فعال کرده و منجر به تشکیل متابولیتهای ثانویه میشوند. علاوه بر این، مطالعه دیگری نشان داد که کاهش سایه، میزان قرار گرفتن در معرض نور خورشید را افزایش میدهد و در نتیجه دمای روز را در زیستگاه طبیعی *Hypericum perforatum* افزایش میدهد که این امر نیز به افزایش عملکرد هیپریسین کمک میکند. بر اساس این دادهها، این مطالعه نقش نانوذرات آهن را به عنوان القاکنندههای بالقوه در کشت بافت بررسی کرد. نتایج نشان داد که این نانوذرات میتوانند ژنهای دخیل در بیوسنتز هسپریدین را از طریق تحریک آنزیمی فعال کنند و منجر به افزایش تجمع این ترکیب شوند (شکل 2). بنابراین، در مقایسه با گیاهانی که در شرایط طبیعی رشد میکنند، میتوان استدلال کرد که تولید چنین ترکیباتی در داخل بدن نیز میتواند زمانی که تنش متوسط با فعالسازی ژنهای دخیل در بیوسنتز متابولیتهای ثانویه ترکیب میشود، افزایش یابد. تیمارهای ترکیبی عموماً تأثیر مثبتی بر میزان باززایی دارند، اما در برخی موارد، این اثر ضعیف میشود. نکته قابل توجه این است که تیمار با 1 میلیگرم در لیتر 2,4-D، 1.5 میلیگرم در لیتر کیناز و غلظتهای مختلف میتواند به طور مستقل و قابل توجهی میزان باززایی را در مقایسه با گروه کنترل 50.85٪ افزایش دهد (شکل 4c). این نتایج نشان میدهد که ترکیبات خاصی از نانوهورمونها میتوانند به صورت همافزایی برای افزایش رشد گیاه و تولید متابولیت عمل کنند، که برای کشت بافت گیاهان دارویی از اهمیت بالایی برخوردار است. پالمر و کلر [50] نشان دادند که تیمار 2,4-D میتواند به طور مستقل تشکیل کالوس را در گیاه سنت پرفوراتوم القا کند، در حالی که افزودن کیناز به طور قابل توجهی تشکیل کالوس و باززایی را افزایش میدهد. این اثر به دلیل بهبود تعادل هورمونی و تحریک تقسیم سلولی بود. بال و همکاران [51] دریافتند که تیمار Fe₃O₄-NP میتواند به طور مستقل عملکرد آنزیمهای آنتیاکسیدان را افزایش دهد و در نتیجه رشد ریشه را در سنت پرفوراتوم افزایش دهد. محیطهای کشت حاوی نانوذرات Fe₃O₄ در غلظتهای 0.5 میلیگرم در لیتر، 1 میلیگرم در لیتر و 1.5 میلیگرم در لیتر، سرعت باززایی گیاهان کتان را بهبود بخشیدند [52]. استفاده از کینتین، 2،4-دیکلروبنزوتیازولینون و نانوذرات Fe₃O₄ به طور قابل توجهی سرعت تشکیل کالوس و ریشه را بهبود بخشید، با این حال، عوارض جانبی بالقوه استفاده از این هورمونها برای باززایی درون شیشهای باید در نظر گرفته شود. به عنوان مثال، استفاده طولانی مدت یا با غلظت بالا از 2،4-دیکلروبنزوتیازولینون یا کینتین ممکن است منجر به تغییرات کلونال سوماتیک، استرس اکسیداتیو، مورفولوژی غیرطبیعی کالوس یا شیشهای شدن شود. بنابراین، سرعت باززایی بالا لزوماً پایداری ژنتیکی را پیشبینی نمیکند. همه گیاهان باززایی شده باید با استفاده از نشانگرهای مولکولی (مانند RAPD، ISSR، AFLP) یا تجزیه و تحلیل سیتوژنتیکی ارزیابی شوند تا همگنی و شباهت آنها با گیاهان درون شیشهای تعیین شود [53،54،55].
این مطالعه برای اولین بار نشان داد که استفاده ترکیبی از تنظیمکنندههای رشد گیاهی (2,4-D و کینتین) با نانوذرات Fe₃O₄ میتواند ریختزایی و تجمع متابولیتهای زیستفعال کلیدی (از جمله هیپریسین و هیپروساید) را در *Hypericum perforatum* افزایش دهد. رژیم درمانی بهینهشده (1 میلیگرم در لیتر 2,4-D + 1 میلیگرم در لیتر کینتین + 4 میلیگرم در لیتر Fe₃O₄-NPs) نه تنها تشکیل کالوس، اندامزایی و عملکرد متابولیت ثانویه را به حداکثر رساند، بلکه یک اثر القای خفیف را نیز نشان داد که به طور بالقوه تحمل تنش گیاه و ارزش دارویی آن را بهبود میبخشد. ترکیب فناوری نانو و کشت بافت گیاهی، بستری پایدار و کارآمد برای تولید آزمایشگاهی ترکیبات دارویی در مقیاس بزرگ فراهم میکند. این نتایج راه را برای کاربردهای صنعتی و تحقیقات آینده در مورد مکانیسمهای مولکولی، بهینهسازی دوز و دقت ژنتیکی هموار میکند و در نتیجه تحقیقات بنیادی در مورد گیاهان دارویی را با بیوتکنولوژی کاربردی پیوند میدهد.
زمان ارسال: ۱۲ دسامبر ۲۰۲۵