داروی ضد کرم N,N-دی اتیل-ام-تولوآمید (دیتگزارش شده است که (DEET) آنزیم استیل کولین استراز (AChE) را مهار می‌کند و به دلیل رگ‌زایی بیش از حد، خواص سرطان‌زایی بالقوه‌ای دارد. در این مقاله، ما نشان می‌دهیم که DEET به طور خاص سلول‌های اندوتلیال را که رگ‌زایی را تقویت می‌کنند، تحریک می‌کند و در نتیجه رشد تومور را افزایش می‌دهد. DEET فرآیندهای سلولی منجر به رگ‌زایی، از جمله تکثیر، مهاجرت و چسبندگی را فعال می‌کند. این امر با افزایش تولید NO و بیان VEGF در سلول‌های اندوتلیال همراه است. خاموش کردن M3 یا استفاده از مهارکننده‌های دارویی M3 همه این اثرات را از بین برد، که نشان می‌دهد رگ‌زایی ناشی از DEET حساس به M3 است. آزمایش‌هایی که شامل سیگنالینگ کلسیم در سلول‌های اندوتلیال و HEK با بیان بیش از حد گیرنده‌های M3 هستند، و همچنین مطالعات اتصال و داکینگ، نشان می‌دهد که DEET به عنوان یک تعدیل‌کننده آلوستریک گیرنده‌های M3 عمل می‌کند. علاوه بر این، DEET آنزیم AChE را مهار می‌کند و در نتیجه فراهمی زیستی استیل کولین و اتصال آن به گیرنده‌های M3 را افزایش می‌دهد و اثرات پیش رگ‌زایی را از طریق تنظیم آلوستریک تقویت می‌کند.
سلول‌های اندوتلیال اولیه از آئورت موش‌های سوئیسی جدا شدند. روش استخراج از پروتکل کوبایاشی 26 اقتباس شده بود. سلول‌های اندوتلیال موشی در محیط EBM-2 غنی‌شده با 5٪ FBS غیرفعال‌شده با حرارت تا پاساژ چهارم کشت داده شدند.
تأثیر دو غلظت DEET بر تکثیر HUVEC، U87MG یا BF16F10 با استفاده از کیت سنجش تکثیر سلولی CyQUANT (Molecular Probes, C7026) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. به طور خلاصه، 5.103 سلول در هر چاهک در یک پلیت 96 چاهکی کشت داده شدند، اجازه داده شد یک شب بچسبند و سپس به مدت 24 ساعت با DEET تیمار شدند. پس از برداشتن محیط رشد، محلول اتصال رنگ را به هر چاهک میکروپلیت اضافه کنید و سلول‌ها را به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. سطوح فلورسانس با استفاده از یک دستگاه میکروپلیت خوان چند حالته Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) مجهز به فیلترهای تحریک 485 نانومتر و فیلترهای انتشار 530 نانومتر تعیین شد.
سلول‌های HUVEC در پلیت‌های ۹۶ چاهکی با تراکم ۱۰۴ سلول در هر چاهک کشت داده شدند. سلول‌ها به مدت ۲۴ ساعت با DEET تیمار شدند. زیست‌پذیری سلول‌ها با استفاده از روش رنگ‌سنجی MTT (سیگما-آلدریچ، M5655) ارزیابی شد. مقادیر چگالی نوری با استفاده از یک دستگاه میکروپلیت خوان چند حالته (Mithras LB940) در طول موج ۵۷۰ نانومتر به دست آمد.
اثرات DEET با استفاده از سنجش‌های رگ‌زایی در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) مورد مطالعه قرار گرفت. درمان با DEET با غلظت‌های 10-8 مولار یا 10-5 مولار، تشکیل طول مویرگی را در HUVECها افزایش داد (شکل 1a، b، نوارهای سفید). در مقایسه با گروه کنترل، درمان با غلظت‌های DEET از 10-14 تا 10-5 مولار نشان داد که طول مویرگی در غلظت 10-8 مولار DEET به یک سطح ثابت رسید (شکل تکمیلی S2). هیچ تفاوت معنی‌داری در اثر پیش رگ‌زایی آزمایشگاهی HUVECهای تیمار شده با DEET در محدوده غلظتی 10-8 مولار و 10-5 مولار مشاهده نشد.
برای تعیین اثر DEET بر نئوواسکولاریزاسیون، ما مطالعات نئوواسکولاریزاسیون درون تنی (in vivo) را انجام دادیم. پس از 14 روز، موش‌هایی که سلول‌های اندوتلیال آنها با 10-8 مولار یا 10-5 مولار DEET از قبل کشت داده شده بود، افزایش قابل توجهی در محتوای هموگلوبین نشان دادند (شکل 1c، نوارهای سفید).
علاوه بر این، نئوواسکولاریزاسیون ناشی از DEET در موش‌های حامل پیوند زنوگرافت U87MG که روزانه (ip) با DEET با دوزی که غلظت پلاسمایی 10-5 M را القا می‌کند، که در انسان‌های در معرض آن طبیعی است، تزریق می‌شدند، در سال 23 مورد مطالعه قرار گرفت. تومورهای قابل تشخیص (یعنی تومورهای >100 میلی‌متر مکعب) 14 روز پس از تزریق سلول‌های U87MG به موش‌ها مشاهده شد. در روز 28، رشد تومور در موش‌های تحت درمان با DEET در مقایسه با موش‌های کنترل به طور قابل توجهی افزایش یافته بود (شکل 1d، مربع‌ها). علاوه بر این، رنگ‌آمیزی CD31 تومورها نشان داد که DEET به طور قابل توجهی مساحت مویرگی را افزایش می‌دهد اما تراکم ریزرگ‌ها را افزایش نمی‌دهد. (شکل 1e-g).
برای تعیین نقش گیرنده‌های موسکارینی در تکثیر القا شده توسط DETA، از 10-8 مولار یا 10-5 مولار DETA در حضور pFHHSiD (10-7 مولار، یک آنتاگونیست انتخابی گیرنده M3) استفاده شد. درمان HUVEC. pFHHSiD به طور کامل خواص تکثیری DETA را در تمام غلظت‌ها مسدود کرد (جدول 1).
تحت این شرایط، ما همچنین بررسی کردیم که آیا DEET طول مویرگی را در سلول‌های HUVEC افزایش می‌دهد یا خیر. به طور مشابه، pFHHSiD به طور قابل توجهی از طول مویرگی ناشی از DEET جلوگیری کرد (شکل 1a، b، نوارهای خاکستری). علاوه بر این، آزمایش‌های مشابهی با M3 siRNA انجام شد. اگرچه siRNA کنترل در ترویج تشکیل مویرگی مؤثر نبود، خاموش کردن گیرنده موسکارینی M3 توانایی DEET در افزایش طول مویرگی را از بین برد (شکل 1a، b، نوارهای سیاه).
علاوه بر این، هم رگ‌زایی القا شده توسط DEET با غلظت 10-8 M یا 10-5 M در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) و هم رگ‌زایی جدید در شرایط درون‌تنی (in vivo) به طور کامل توسط pFHHSiD مسدود شدند (شکل 1c، d، دایره‌ها). این نتایج نشان می‌دهد که DEET رگ‌زایی را از طریق مسیری حساس به آنتاگونیست‌های انتخابی گیرنده M3 یا siRNA M3 تقویت می‌کند.
AChE هدف مولکولی DEET است. داروهایی مانند دونپزیل که به عنوان مهارکننده‌های AChE عمل می‌کنند، می‌توانند رگ‌زایی سلول‌های اندوتلیال را در شرایط آزمایشگاهی و در مدل‌های ایسکمی اندام حرکتی عقبی موش تحریک کنند14. ما اثر دو غلظت DEET را بر فعالیت آنزیم AChE در HUVEC آزمایش کردیم. غلظت‌های پایین (10-8 M) و بالا (10-5 M) DEET فعالیت AChE اندوتلیال را در مقایسه با شرایط کنترل کاهش داد (شکل 2).
هر دو غلظت DEET (10-8 M و 10-5 M) فعالیت استیل کولین استراز را در HUVEC کاهش دادند. از BW284c51 (10-5 M) به عنوان کنترل برای مهارکننده‌های استیل کولین استراز استفاده شد. نتایج به صورت درصد فعالیت AChE در HUVEC تیمار شده با دو غلظت DEET در مقایسه با سلول‌های تیمار شده با حامل بیان شده‌اند. مقادیر به صورت میانگین ± SEM شش آزمایش مستقل بیان شده‌اند. *p < 0.05 در مقایسه با کنترل (آزمون مقایسه چندگانه کروسکال-والیس و دان).
اکسید نیتریک (NO) در فرآیند رگ‌زایی دخیل است33، بنابراین، تولید NO در HUVEC های تحریک‌شده با DEET مورد مطالعه قرار گرفت. تولید NO اندوتلیال تحت درمان با DEET در مقایسه با سلول‌های کنترل افزایش یافت، اما تنها در دوز 10-8 M به میزان معنی‌داری رسید (شکل 3c). برای تعیین تغییرات مولکولی کنترل‌کننده تولید NO ناشی از DEET، بیان و فعال‌سازی eNOS با وسترن بلات مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. اگرچه درمان DEET بیان eNOS را تغییر نداد، اما فسفوریلاسیون eNOS را در محل فعال‌سازی آن (Ser-1177) به طور قابل توجهی افزایش داد در حالی که محل مهار آن (Thr-495) را در مقایسه با سلول‌های تیمار نشده در فسفوریلاسیون eNOS کاهش داد (شکل 3d). علاوه بر این، نسبت eNOS فسفریله شده در محل فعال‌سازی و محل مهار پس از نرمال‌سازی مقدار eNOS فسفریله شده به مقدار کل آنزیم محاسبه شد. این نسبت در HUVEC های تیمار شده با هر غلظت DEET در مقایسه با سلول‌های تیمار نشده به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 3d).
در نهایت، بیان VEGF، یکی از عوامل اصلی پیش رگ‌زایی، با وسترن بلات مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. DEET بیان VEGF را به طور قابل توجهی افزایش داد، در حالی که pFHHSiD این بیان را به طور کامل مسدود کرد.
از آنجایی که اثرات DEET هم به انسداد دارویی و هم به کاهش تنظیم گیرنده‌های M3 حساس است، ما این فرضیه را که DEET ممکن است سیگنالینگ کلسیم را افزایش دهد، آزمایش کردیم. با کمال تعجب، DEET نتوانست کلسیم سیتوپلاسمی را در HUVEC (داده‌ها نشان داده نشده است) و HEK/M3 (شکل 4a، b) برای هر دو غلظت مورد استفاده افزایش دهد.
زمان ارسال: 30 دسامبر 2024