داروی ضد کرم N,N-دی اتیل-m-تولوامید (DEET) از طریق مدولاسیون آلوستریک گیرنده های موسکارینی M3 در سلول های اندوتلیال باعث ایجاد رگ زایی می شود.

  
داروی ضد کرم N,N-diethyl-m-toluamide (DEETگزارش شده است که AChE (استیل کولین استراز) را مهار می کند و به دلیل عروق بیش از حد دارای خواص سرطان زایی بالقوه است. در این مقاله، ما نشان می‌دهیم که DEET به طور خاص سلول‌های اندوتلیال را تحریک می‌کند که رگ‌زایی را ترویج می‌کنند و در نتیجه رشد تومور را افزایش می‌دهند. DEET فرآیندهای سلولی را فعال می کند که منجر به رگزایی می شود، از جمله تکثیر، مهاجرت و چسبندگی. این با افزایش تولید NO و بیان VEGF در سلول های اندوتلیال همراه است. خاموش کردن M3 یا استفاده از مهارکننده‌های دارویی M3 تمام این اثرات را لغو کرد، که نشان می‌دهد رگ‌زایی ناشی از DEET به M3 حساس است. آزمایش‌هایی که شامل سیگنال‌دهی کلسیم در سلول‌های اندوتلیال و HEK هستند که گیرنده‌های M3 را بیش از حد بیان می‌کنند، و همچنین مطالعات اتصال و اتصال، نشان می‌دهند که DEET به عنوان یک تعدیل‌کننده آلوستریک گیرنده‌های M3 عمل می‌کند. علاوه بر این، DEET AChE را مهار می کند، در نتیجه فراهمی زیستی استیل کولین و اتصال آن به گیرنده های M3 را افزایش می دهد و اثرات پیش رگ زایی را از طریق تنظیم آلوستریک افزایش می دهد.
EC های اولیه از آئورت موش سوئیسی جدا شد. روش استخراج از پروتکل کوبایاشی اقتباس شده است 26 . ECهای موش تا پاساژ چهارم در محیط EBM-2 همراه با 5 درصد FBS غیرفعال شده با حرارت کشت داده شدند.
اثر دو غلظت DEET بر تکثیر HUVEC، U87MG، یا BF16F10 با استفاده از کیت سنجش تکثیر سلولی CyQUANT (پروب مولکولی، C7026) تجزیه و تحلیل شد. به طور خلاصه، 5.103 سلول در هر چاهک در یک صفحه 96 چاهی کاشته شد، اجازه داده شد تا یک شبه بچسبد و سپس به مدت 24 ساعت با DEET تیمار شد. پس از خارج کردن محیط رشد، محلول اتصال رنگ را به هر چاهک میکروپلیت اضافه کنید و سلول ها را در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید. سطوح فلورسانس با استفاده از یک میکروپلیت خوان چند حالته Mithras LB940 (برتولد تکنولوژی، باد وایلدباد، آلمان) مجهز به فیلترهای تحریک 485 نانومتری و فیلترهای انتشار 530 نانومتری تعیین شد.
HUVEC در صفحات 96 چاهی با تراکم 104 سلول در هر چاهک کاشته شد. سلول ها با DEET به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. زنده ماندن سلول با استفاده از روش رنگ سنجی MTT (Sigma-Aldrich، M5655) ارزیابی شد. مقادیر چگالی نوری بر روی یک میکروپلیت خوان چند حالته (Mithras LB940) در طول موج 570 نانومتر به دست آمد.
اثرات DEET با استفاده از روش‌های رگ‌زایی در شرایط آزمایشگاهی مورد مطالعه قرار گرفت. درمان با 10-8 M یا 10-5 M DEET باعث افزایش تشکیل طول مویرگی در HUVECها شد (شکل 1a، b، نوارهای سفید). در مقایسه با گروه کنترل، تیمار با غلظت‌های DEET در محدوده 10-14 تا 10-5 مولار نشان داد که طول مویرگی در 10-8 M DEET به یک فلات رسیده است (شکل S2 تکمیلی). تفاوت معنی داری در اثر پیش رگ زایی در شرایط آزمایشگاهی HUVECهای تیمار شده با DEET در محدوده غلظت 10-8 M و 10-5 M یافت نشد.
برای تعیین اثر DEET بر نئوواسکولاریزاسیون، ما مطالعات in vivo neovascularization را انجام دادیم. پس از 14 روز، موش های تزریق شده با سلول های اندوتلیال که با 10-8 M یا 10-5 M DEET کشت شده بودند، افزایش قابل توجهی در محتوای هموگلوبین نشان دادند (شکل 1c، نوارهای سفید).
علاوه بر این، نئوواسکولاریزاسیون ناشی از DEET در موش‌های دارای پیوند زنوگرافت U87MG که روزانه (IP) با DEET با دوز شناخته شده برای القای غلظت پلاسمایی 10-5 مولار تزریق می‌شدند، مورد مطالعه قرار گرفت، که در انسان‌های در معرض طبیعی است. در 23. تومورهای قابل تشخیص (یعنی تومورهای > 100 میلی متر مکعب) 14 روز پس از تزریق سلول های U87MG به موش مشاهده شد. در روز 28، رشد تومور در موش های تحت درمان با DEET در مقایسه با موش های کنترل به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 1d، مربع). علاوه بر این، رنگ‌آمیزی CD31 تومورها نشان داد که DEET به طور قابل‌توجهی باعث افزایش سطح مویرگ‌ها شد، اما تراکم عروق ریز را افزایش نداد. (شکل 1e–g).
برای تعیین نقش گیرنده های موسکارینی در تکثیر ناشی از DETA، 10-8 M یا 10-5 M DETA در حضور pFHHSiD (10-7 M، یک آنتاگونیست انتخابی گیرنده M3) استفاده شد. درمان HUVEC pFHHSiD به طور کامل خواص تکثیری DETA را در تمام غلظت ها مسدود کرد (جدول 1).
تحت این شرایط، ما همچنین بررسی کردیم که آیا DEET طول مویرگی را در سلول‌های HUVEC افزایش می‌دهد یا خیر. به طور مشابه، pFHHSiD به طور قابل توجهی از طول مویرگی ناشی از DEET جلوگیری کرد (شکل 1a، b، نوارهای خاکستری). علاوه بر این، آزمایش‌های مشابهی با M3 siRNA انجام شد. اگرچه siRNA کنترل در ترویج تشکیل مویرگی موثر نبود، خاموش کردن گیرنده موسکارینی M3 توانایی DEET برای افزایش طول مویرگی را لغو کرد (شکل 1a، b، نوارهای سیاه).
علاوه بر این، هر دو عروق 10-8 M یا 10-5 M DEET در شرایط آزمایشگاهی و نئوواسکولاریزاسیون در داخل بدن به طور کامل توسط pFHHSiD مسدود شدند (شکل 1c، d، دایره‌ها). این نتایج نشان می‌دهد که DEET رگ‌زایی را از طریق مسیری حساس به آنتاگونیست‌های انتخابی گیرنده M3 یا M3 siRNA ترویج می‌کند.
AChE هدف مولکولی DEET است. داروهایی مانند دونپزیل که به عنوان مهارکننده های AChE عمل می کنند، می توانند رگزایی EC را در شرایط آزمایشگاهی و در مدل های ایسکمی اندام عقبی موش تحریک کنند. ما تأثیر دو غلظت DEET را بر فعالیت آنزیم استروژن در HUVEC آزمایش کردیم. غلظت های کم (10-8 مولار) و بالا (10-5 مولار) DEET باعث کاهش فعالیت AChE اندوتلیال در مقایسه با شرایط کنترل شد (شکل 2).
هر دو غلظت DEET (10-8 M و 10-5 M) فعالیت استیل کولین استراز را در HUVEC کاهش دادند. BW284c51 (10-5 M) به عنوان کنترل برای مهار کننده های استیل کولین استراز استفاده شد. نتایج به عنوان درصد فعالیت AChE در HUVEC تیمار شده با دو غلظت DEET در مقایسه با سلول‌های تیمار شده با وسیله نقلیه بیان می‌شوند. مقادیر به صورت میانگین ± SEM شش آزمایش مستقل بیان می شوند. *p<0.05 نسبت به شاهد (آزمون مقایسه چندگانه کروسکال-والیس و دان).
اکسید نیتریک (NO) در فرآیند رگ زایی 33 نقش دارد، بنابراین، تولید NO در HUVEC های تحریک شده با DEET مورد مطالعه قرار گرفت. تولید NO اندوتلیال تیمار شده با DEET در مقایسه با سلول های کنترل افزایش یافت، اما تنها در دوز 10-8 مولار به اهمیت رسید (شکل 3c). برای تعیین تغییرات مولکولی کنترل کننده تولید NO ناشی از DEET، بیان و فعال سازی eNOS با وسترن بلات مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. اگرچه درمان DEET بیان eNOS را تغییر نداد، اما به طور قابل توجهی فسفوریلاسیون eNOS را در محل فعال کننده آن (Ser-1177) افزایش داد در حالی که مکان مهاری آن (Thr-495) را در مقایسه با سلول های تیمار نشده در فسفوریلاسیون eNOS کاهش داد (شکل 3d). علاوه بر این، نسبت eNOS فسفریله در محل فعال‌سازی و محل مهار پس از نرمال‌سازی مقدار eNOS فسفریله به مقدار کل آنزیم محاسبه شد. این نسبت در HUVECهای تیمار شده با هر غلظت DEET در مقایسه با سلول های تیمار نشده به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 3d).
در نهایت، بیان VEGF، یکی از عوامل اصلی پیش رگ زایی، با وسترن بلات مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. DEET به طور قابل توجهی بیان VEGF را افزایش داد، در حالی که pFHHSiD به طور کامل این بیان را مسدود کرد.
از آنجایی که اثرات DEET به محاصره دارویی و کاهش گیرنده های M3 حساس است، ما این فرضیه را آزمایش کردیم که DEET ممکن است سیگنال دهی کلسیم را افزایش دهد. با کمال تعجب، DEET نتوانست کلسیم سیتوپلاسمی را در HUVEC (داده‌ها نشان داده نشده است) و HEK/M3 (شکل 4a, b) را برای هر دو غلظت مورد استفاده افزایش دهد.