آفتکشها نقش مهمی در رفع کمبود جهانی غذا و مبارزه با بیماریهای منتقله از ناقلین در انسان دارند. با این حال، مشکل رو به رشد مقاومت در برابر آفتکشها، نیاز مبرمی به کشف ترکیبات جدیدی دارد که اهداف کم استفاده را هدف قرار دهند. کانالهای پتانسیل گیرنده گذرای حشرات (TRPV) - Nanzhong (Nan) و غیرفعال (Iav) - میتوانند کانالهای هترولوگ (Nan-Iav) تشکیل دهند و در اندامهای مکانیکی-حسی که واسطه ژئوتروپیسم، شنوایی و حس عمقی در حشرات هستند، قرار گیرند. برخی از آفتکشها، مانند آفیدوپیرولیدون (AP)، Nan-Iav را از طریق مکانیسمهای ناشناخته هدف قرار میدهند. AP در برابر حشرات مکنده سوراخکننده (hemipterans) مؤثر است و با مختل کردن عملکرد رشتهها از تغذیه جلوگیری میکند. AP فقط میتواند به Nan متصل شود، اما فقط Nan-Iav میتواند با آگونیستها، از جمله نیکوتینآمید درونزا (NAM) تعامل داشته باشد و در نتیجه فعالیت کانال را نشان دهد. علیرغم پتانسیل Nan-Iav به عنوان یک هدف حشرهکش، اطلاعات کمی در مورد مونتاژ کانال، جایگاههای اتصال تنظیمی و تنظیم وابسته به Ca2+ آن وجود دارد که مانع توسعه بیشتر حشرهکشها میشود. در این مطالعه، از میکروسکوپ الکترونی کرایو برای تعیین ساختار Nan-Iav در حشرات Hemiptera در حالت بدون کالمودولین-لیگاند و همچنین با AP و NAM در مرز دامنه سیتوپلاسمی تکرار شونده آنکیرین (ARD) استفاده شد. با کمال تعجب، ما دریافتیم که خود پروتئین Nan میتواند یک پنتامر تشکیل دهد که توسط فعل و انفعالات ARD با واسطه AP تثبیت میشود. این مطالعه فعل و انفعالات مولکولی بین حشرهکشها و آگونیستها و Nan-Iav را آشکار میکند و اهمیت ARD را در عملکرد و مونتاژ کانال برجسته میکند و مکانیسم تنظیم Ca2+ را بررسی میکند.
در بحبوحه تغییرات اقلیمی جهانی که به طور فزایندهای شدید میشود، وخامت امنیت غذایی جهانی یکی از چالشهای عمده قرن بیست و یکم است که پیامدهای گستردهای برای جامعه دارد.۱،۲گزارش وضعیت امنیت غذایی و تغذیه در جهان ۲۰۲۳ (SOFI) سازمان بهداشت جهانی تخمین میزند که تقریباً ۲.۳۳ میلیارد نفر در سراسر جهان از ناامنی غذایی متوسط تا شدید رنج میبرند که یک مشکل دیرینه است.۳،۴متأسفانه، تخمین زده میشود که سالانه ۲۰ تا ۳۰ درصد یا بیشتر از محصولات کشاورزی در اثر آفات و عوامل بیماریزا از بین میروند و انتظار میرود گرمایش جهانی، مقاومت آفات و آسیبپذیری محصولات کشاورزی را تشدید کند.۴،۵،۶،۷،۸توسعه آفتکشها نه تنها برای محافظت از محصولات کشاورزی در برابر آفات و کاهش شیوع عوامل بیماریزای منتقله از طریق ناقلین، بلکه برای مبارزه با بیماریهای منتقله از طریق ناقلین در انسان مانند تب دنگی، مالاریا و بیماری شاگاس که به طور فزایندهای در برابر آفتکشها مقاوم هستند، بسیار مهم است.۵،۹،۱۰،۱۱
در میان اهداف اصلی حشرهکشهای نوروتوکسیک، کانال هتروتترامری TRPV به نام Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) نشاندهنده دستهای از اهداف حشرهکش است که تنها در دهه گذشته کشف شدهاند، از جمله حشرهکشهای تجاری موجود مانند ایمیداکلوپرید و پیراکلوستروبین.۱۲،۱۳،۱۴حشرهکش نیمهسنتزی آفیدوپیرولفن (AP) محصولی است که اخیراً توسعه یافته و تجاری شده است و جزء اصلی آن حشرهکش فعال Inscalis® است که با سطح فعالیت زیر نانومولار به AP متصل میشود.15AP سمیت حاد کمی برای گرده افشانها، حشرات مفید و سایر موجودات غیر هدف نشان میدهد و در صورت استفاده طبق دستورالعمل روی برچسب، میتواند فشار مقاومت به سایر حشرهکشها را کاهش دهد.۱۶،۱۷،۱۸ژنهای Nan و Iav به طور گسترده در بین گونههای حشرات توزیع شدهاند، فقط در نورونهای گیرنده کششی طنابی شاخکها و اندامها به طور همزمان بیان میشوند و برای شنوایی، درک جاذبه و حس عمقی حیاتی هستند.۱۳،۱۶،۱۹،۲۰،۲۱،۲۲AP، ایمیداکلوپرید و پیراکلوستروبین از طریق یک مکانیسم منحصر به فرد، کمپلکس Nan-Iav را تحریک میکنند و در نهایت انتقال سیگنال حس عمقی را مهار میکنند.۱۳،۱۶،۲۳در حشرات مکندهی سوراخکننده (hemipterans) مانند شتهها و مگسهای سفید، از دست دادن حس عمقی، توانایی تغذیهی آنها را مختل میکند و در نهایت منجر به مرگ میشود.۱۳،۲۴جالب توجه است که AP میل ترکیبی بالایی برای کمپلکس Nan-Iav و میل ترکیبی پایینی برای Nan به تنهایی نشان میدهد. اتصال AP به Nan-Iav جریان الکتریکی را القا میکند، اما اتصال به Nan به تنهایی فعالیت کانال را تحریک نمیکند. خود Iav به هیچ وجه به AP متصل نمیشود.16این نشان میدهد که Nan و Iav ممکن است به یکدیگر متصل شوند تا کمپلکسهای کانال Nan-Iav مختلفی تشکیل دهند (مثلاً با نسبتهای استوکیومتری متفاوت یا آرایشهای مختلف در یک نسبت استوکیومتری یکسان) یا اینکه AP ممکن است به چندین جایگاه متصل شود. علاوه بر این، آگونیست طبیعی نیکوتینآمید (NAM) با میل ترکیبی میکرومولار به Drosophila Nan-Iav متصل میشود و اثراتی مشابه با شتهها (AP) در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) از خود نشان میدهد.۱۶،۲۵و مهار تولید مثل و تغذیه شتهها، که در نهایت منجر به مرگ آنها میشود۲۵،۲۶این دادهها سوالات زیادی را مطرح میکنند. به عنوان مثال، هنوز مشخص نیست که هترودیمر Nan-Iav چگونه تشکیل میشود، کدام جایگاههای اتصال برای تنظیم مولکولهای کوچک استفاده میشوند و چگونه این مولکولهای کوچک با سرکوب حس عمقی، عملکرد کانال را تنظیم میکنند. علاوه بر این، دلایل اینکه چرا خود Nan غیرفعال است و میل ترکیبی کمی با AP دارد، در حالی که هترودیمر Nan-Iav فعال است و با میل ترکیبی بیشتری به AP متصل میشود، هنوز مشخص نیست. در نهایت، اطلاعات کمی در مورد تنظیم وابسته به Ca2+ عملکرد Nan-Iav و نحوه ادغام آن در فرآیندهای سیگنالینگ عصبی وجود دارد.۱۳،۲۱
در این مطالعه، با ترکیب میکروسکوپ الکترونی کرایو، الکتروفیزیولوژی و تکنیکهای اتصال رادیولیگاند، ما نحوهی تجمع Nan-Iav و مکانیسم اتصال آن به تنظیمکنندههای مولکولهای کوچک را روشن کردیم. علاوه بر این، ما کالمودولین (CaM) متصل به Iav و پنتامرهای Nan تثبیتشده با AP را شناسایی کردیم. این نتایج بینشهای مهمی در مورد تنظیم یونهای کلسیم در کانالها، تجمع کانالها و عوامل تعیینکنندهی میل ترکیبی اتصال لیگاند ارائه میدهد. مهمتر از آن، ما تأیید کردیم که ARD نقش محوری در این فرآیندها ایفا میکند. مطالعهی ما در مورد کانالهای کامل حشرات متصل به آفتکشهای کشاورزی مرتبط۲۷، ۲۸، ۲۹چشماندازهایی را برای توسعه صنعت آفتکشها، بهبود اثربخشی و اختصاصیت آفتکشها و امکان استفاده از ترکیبات هدفمند TRPV برای سایر گونهها به منظور رسیدگی به امنیت غذایی جهانی و شیوع بیماریهای منتقله از طریق ناقلین، فراهم میکند.
ما همچنین دریافتیم که Nan-Iav توسط Ca2+ تنظیم میشود و مکانیسم تنظیم توسط CaM متصل به ساختار واسطهگری میشود. نکته مهم این است که این تنظیم وابسته به Ca2+ Nav توسط CaM به طور قابل توجهی با مکانیسمهای تنظیم سایر کانالهای یونی (به عنوان مثال، کانالهای Na+ وابسته به ولتاژ و کانالهای TRPV5/6) متفاوت است.۵۲،۵۳،۵۴،۵۵،۵۶،۵۷در کانال Nav1.2، دامنه C-ترمینال CaM به صورت مارپیچی با دامنه C-ترمینال (CTD) مرتبط میشود و Ca2+ باعث اتصال دامنه N-ترمینال آن به قسمت دیستال CTD میشود.56در کانال TRPV5/6، دامنه C-ترمینال CaM به CTH متصل میشود و Ca2+ باعث گسترش رو به بالای دامنه N-ترمینال آن به داخل منافذ میشود و در نتیجه نفوذپذیری کاتیون را مسدود میکند.۵۳،۵۴ما مدلی برای عملکرد تنظیمشده توسط Ca2+ توسط Nan-Iav-CaM پیشنهاد میکنیم (شکل 4h). در این مدل، دامنه N-ترمینال CaM به طور مداوم به دامنه C-ترمینال (CTH) Iav متصل میشود. در حالت استراحت (غلظت پایین [Ca2+])، دامنه C-ترمینال CaM با Nan تعامل میکند، ساختار ARD را تثبیت میکند و در نتیجه باعث باز شدن کانال میشود. اتصال یک آگونیست/حشرهکش به کانال باعث باز شدن منافذ میشود که منجر به ورود Ca2+ میشود. سپس Ca2+ به CaM متصل میشود و باعث تفکیک دامنه C-ترمینال از ARD Nan میشود. از آنجا که مسدود کردن اتصال CaM اساساً اثر مهاری Ca2+ را از بین میبرد، این تفکیک، تحرک ARD را تعدیل میکند و در نتیجه باعث مهار یا حساسیتزدایی وابسته به Ca2+ میشود. بازیابی سریع جریانهای کانال پس از شستشوی یون کلسیم (شکل 4g) نشان میدهد که این مکانیسم، پاسخهای سریع به سیگنالهای عصبی با واسطه Ca2+ را تسهیل میکند. علاوه بر این، گزارش شده است که ناحیه C-ترمینال Iav، که هنوز به خوبی شناخته نشده است، نقشهای دیگری در هدفگیری کانال و تنظیم جریان ایفا میکند.21
در نهایت، مطالعه ما ساختار با وضوح بالای یک کمپلکس کانال TRP حشرهکش-حشرهکش با اهمیت کشاورزی را ارائه میدهد - کشفی که قبلاً برای ما ناشناخته بود. نکته قابل توجه این است که ما ساختار و عملکرد کانال حشرات را در سلولهای انسانی (HEK293S GnTi–) به جای سلولهای حشرات مشخص کردیم. در مواجهه با افزایش مقاومت به حشرهکشها و فشار مداوم بر امنیت غذایی و عوامل بیماریزا، کار ما اطلاعات مهمی را ارائه میدهد که توسعه حشرهکشهای جدید را به نفع سلامت انسان و امنیت غذایی جهانی تسهیل میکند. مطالعات نشان دادهاند که حشرهکشهایی مانند AP در صورت استفاده طبق دستورالعملهای برچسب، در برابر برخی آفات مؤثر هستند و سمیت حاد کمی برای گرده افشانهای مفید دارند که نشاندهنده ایمنی زیستمحیطی آنها است.۱۳،۱۶علاوه بر این، آزمایش برخی از مشتقات AP روی پشهها نشان داده است که آنها در نهایت توانایی پرواز خود را از دست میدهند. درک چگونگی اتصال این ترکیبات تعدیلکننده به Nan-Iav، اصلاح ترکیبات موجود یا توسعه ترکیبات جدید برای اثربخشی بیشتر ودقیقکنترل آفات. مطالعه ما نشان میدهد که رابط ARD Nan-Iav نه تنها برای تنظیم فعالیت ترکیبات درونزا، آفتکشها و Ca2+-CaM، بلکه برای مونتاژ کانال نیز حیاتی است. ما پیشنهاد میکنیم که مختل کردن مونتاژ هترودایمر با مولکولهای کوچک ممکن است یک رویکرد منحصر به فرد و امیدوارکننده برای توسعه مهارکنندههای کانال یونی باشد.
از میان هشت ژن ارتولوگ، ژنهای کامل سوسک قهوهای (Halyomorpha halys) Nanchung و Inactive انتخاب شدند که پایداری عالی در شویندهها نشان دادند. ژنهای سنتز شده از نظر کدون برای بیان انسانی بهینه شده و با استفاده از جایگاههای برشی XhoI و EcoRI در ناقل pCMV-DEST شرکت pBacMam (Life Technologies) کلون شدند. این امر تضمین میکرد که کلونها در چارچوب برچسبهای GFP-FLAG-10xHis و mCherry-FLAG-10xHis انتهای C قرار دارند که توسط پروتئاز HRC-3C (PPX) برش داده میشوند و امکان تکثیر مستقل را فراهم میکنند.بیانآغازگرهای مورد استفاده برای کلون کردن Nanchung و Inactive در ناقل pBacMam به شرح زیر بودند:
تصاویر میکروسکوپی از ذرات منفرد با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری Titan Krios G2 (FEI) مجهز به دوربین K3 و فیلتر انرژی Gatan BioQuantum به دست آمد. میکروسکوپ با انرژی 300 کیلوالکترونولت، با تنظیم انرژی 20 الکترونولت، اندازه پیکسل نمونه 1.08 آنگستروم بر پیکسل (بزرگنمایی اسمی 81000 برابر) و گرادیان فوکوس از -0.8 تا -2.2 میکرومتر کار میکرد. ضبط ویدیو با سرعت 40 فریم در ثانیه با استفاده از میکروسکوپ Latitude S (Gatan) با نرخ دوز اسمی 25 e-px−1 s−1، زمان نوردهی 2.4 ثانیه و دوز کل تقریباً 60 e-Å−2 انجام شد.
تصحیح حرکت ناشی از پرتو و وزندهی دوز با استفاده از MotionCor2 در RELION 4.061 روی فیلم انجام شد. تخمین پارامتر تابع انتقال کنتراست (CTF) در cryoSPARC با استفاده از روش تخمین CTF مبتنی بر وصله62 انجام شد. عکسهای میکروسکوپی با وضوح برازش CTF ≥4 Å از تجزیه و تحلیل بعدی حذف شدند. معمولاً زیرمجموعهای از 500 تا 1000 عکس میکروسکوپی برای انتخاب نقطه در cryoSPARC استفاده میشد و پس از فیلتر کردن، چندین دور طبقهبندی دوبعدی برای به دست آوردن یک تصویر مرجع واضح برای انتخاب ذرات مبتنی بر الگو انجام میشد. سپس ذرات با استفاده از جعبههای محصورکننده 64 پیکسلی و ترکیب 4 تایی استخراج شدند. چندین دور طبقهبندی دوبعدی برای حذف دستههای ذرات ناخواسته انجام شد. مدل سهبعدی اولیه با استفاده از بازسازی ab initio بازسازی و با استفاده از پالایش غیریکنواخت در cryoSPARC اصلاح شد. طبقهبندی سهبعدی بر اساس ناهمگنی ARD در cryoSPARC یا RELION انجام شد. هیچ ناهمگونی قابل توجهی در دامنههای غشایی مشاهده نشد. ذرات با استفاده از روشهای C1 و C2 پالایش شدند؛ ذرات با وضوح بالاتر C2 نسبت به C2 متقارن در نظر گرفته شدند و برای پالایش بیزی به RELION وارد شدند. سپس ذرات برای پالایش نهایی غیریکنواخت و موضعی به cryoSPARC منتقل شدند. وضوح نهایی و تعداد ذرات در جدول 1 نشان داده شده است.
هنگام پردازش پنتامرهای Nan+AP، روشهای مختلفی را برای بهبود وضوح دامنههای غشایی (بهویژه ناحیه منافذ)، مانند تفریق سیگنال و پوشش TMD بررسی کردیم. با این حال، این تلاشها به دلیل بینظمی بالقوه شدید در ناحیه منافذ و ناهمگونی کلی TMD ناموفق بودند. وضوح نهایی با استفاده از ماسکی که بهطور خودکار توسط روش پردازش غیریکنواخت در cryoSPARC تولید میشود، محاسبه شد و در درجه اول ناحیه ARD را هدف قرار داد. این امر وضوح بهطور قابلتوجهی بالاتری نسبت به دامنههای غشایی (بهویژه ناحیه VSLD) به دست آورد.
مدلهای اولیه de novo از اشکال apo گونههای Nanchung و Inactive ابتدا با استفاده از Coot63 تولید شدند و مدلهای گونههای Nan و Iav با استفاده از AlphaFold264 برای شناسایی مناطق با اطمینان پایین تولید شدند. مدلسازی کالمودولین بر اساس برازشهای جسم صلب مدلهای متصل به Ca2+ و بدون Ca2+ به ترتیب در نمونههای PDB 4JPZ56 و 1CFD65 بود. مدلها با استفاده از پالایش کروی اصلاح شدند تا از استریوشیمی صحیح و هندسه خوب اطمینان حاصل شود. سپس فسفاتیدیل کولین، فسفاتیدیل اتانول آمین و فسفاتیدیل سرین به صورت چگالیهای لیپیدی کاملاً تعریف شده مدلسازی شدند و لیگاندهای NAM و AP در چگالیهای مربوطه در اتصالات محکم قرار گرفتند. فایلهای محدودیت از رشته SMILES ایزوفرمها با استفاده از eLBOW در PHENIX66 تولید شدند. در نهایت، مدلها در فضای واقعی در PHENIX با استفاده از جستجوی شبکه محلی و کمینهسازی سراسری با محدودیتهای ساختار ثانویه اصلاح شدند. سرور MolProbity برای اصلاح مدل و تحلیل ساختاری مورد استفاده قرار گرفت و تصاویر با استفاده از PyMOL و UCSF Chimera X انجام شدند. 67،68،69 تحلیل Aperture با استفاده از سرور HOLE انجام شد،70 و نگاشت حفاظت توالی با استفاده از سرور Consurf انجام شد.71
تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرمافزارهای Igor Pro 6.2، Excel Office 365 و GraphPad Prism 7.0 انجام شد. تمام دادههای کمی به صورت میانگین ± خطای استاندارد (SEM) ارائه شدهاند. برای مقایسه دو گروه از آزمون t-student (دو دامنه، بدون جفت) استفاده شد. برای مقایسه چندین گروه از تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) و به دنبال آن آزمون تعقیبی Dunnett استفاده شد. *P< 0.05، **P< 0.01، و ***Pمقادیر کمتر از 0.001 بسته به توزیع دادهها از نظر آماری معنیدار در نظر گرفته شدند. مقادیر Kd، Ki و فواصل اطمینان 95٪ نامتقارن آنها با استفاده از GraphPad Prism 10 محاسبه شدند.
برای جزئیات بیشتر در مورد روش مطالعه، لطفاً به خلاصه گزارش نمونه کارهای طبیعت که در این مقاله لینک شده است، مراجعه کنید.
مدل اولیه با استفاده از مدلهای کالمودولین از پایگاههای داده PDB 4JPZ و 1CFD ساخته شد. مختصات در بانک دادههای پروتئین (PDB) تحت شمارههای دسترسی 9NVN (Nan-Iav-CaM بدون لیگاند)، 9NVO (Nan-Iav-CaM متصل به نیکوتینآمید)، 9NVP (Nan-Iav-CaM متصل به نیکوتینآمید و EDTA)، 9NVQ (Nan-Iav-CaM متصل به آفنیدولپیرولین و کلسیم)، 9NVR (Nan-Iav-CaM متصل به آفنیدولپیرولین و EDTA) و 9NVS (Nan پنتامر متصل به آفنیدولپیرولین) ثبت شدهاند. تصاویر میکروسکوپ الکترونی کرایو مربوطه در پایگاه داده میکروسکوپ الکترونی (EMDB) با شمارههای دسترسی زیر ذخیره شدهاند: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM بدون لیگاند)، EMD-49845 (کمپلکس Nan-Iav-CaM با نیکوتینامید)، EMD-49846 (کمپلکس Nan-Iav-CaM با نیکوتینامید و EDTA)، EMD-49847 (کمپلکس Nan-Iav-CaM با آفیدوپیرولین و کلسیم)، EMD-49848 (کمپلکس Nan-Iav-CaM با آفیدوپیرولین و EDTA) و EMD-49849 (کمپلکس Nan pentamer با آفیدوپیرولین). دادههای خام برای تجزیه و تحلیل عملکردی در این مقاله ارائه شده است.
زمان ارسال: ۲۸ ژانویه ۲۰۲۶