تجزیه و تحلیل ارتباط ژنومی قدرت پاسخ دفاعی ناشی از MAMP و مقاومت به لکه برگی هدف در سورگوم

مواد گیاهی و پاتوژن

یک جمعیت نقشه‌برداری از ارتباط سورگوم که به عنوان جمعیت تبدیل سورگوم (SCP) شناخته می‌شود، توسط دکتر پت براون در دانشگاه ایلینوی (که اکنون در UC Davis است) ارائه شد. این جمعیت قبلاً شرح داده شده است و مجموعه‌ای از لاین‌های متنوع است که به عدم حساسیت به دوره نوری و قد کوتاه‌تر تبدیل شده‌اند تا رشد و نمو گیاهان را در محیط‌های ایالات متحده تسهیل کنند. 510 لاین از این جمعیت در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت، اگرچه به دلیل جوانه‌زنی ضعیف و سایر مشکلات کنترل کیفیت، همه لاین‌ها در تجزیه و تحلیل هر سه صفت استفاده نشدند. در نهایت، داده‌های 345 لاین برای تجزیه و تحلیل پاسخ کیتین، 472 لاین برای پاسخ flg22 و 456 لاین برای مقاومت به TLS استفاده شد.ب. کوکیسویه LSLP18 از دکتر برت بلوم در دانشگاه آرکانزاس تهیه شد.

اندازه‌گیری پاسخ MAMP

در این مطالعه از دو MAMP مختلف flg22 (فهرست Genscript شماره RP19986) و کیتین استفاده شد. گیاهان سورگوم در گلخانه در محفظه‌هایی که روی سطوح مسطح پر از خاک (33٪ مخلوط رشد Sunshine Redi-Earth Pro) قرار داده شده بودند، کشت شدند. گیاهان یک روز قبل از جمع‌آوری نمونه آبیاری شدند تا از رطوبت اضافی برگ در روز جمع‌آوری جلوگیری شود.

لاین‌ها به صورت تصادفی انتخاب شدند و به دلایل لجستیکی، در دسته‌های ۶۰ تایی کاشته شدند. برای هر لاین، سه «گلدان» با دو بذر در هر لاین کاشته شد. دسته‌های بعدی به محض پردازش دسته قبلی کاشته شدند تا کل جمعیت ارزیابی شود. دو آزمایش برای هر دو MAMP انجام شد و ژنوتیپ‌ها در هر دو آزمایش دوباره تصادفی شدند.

سنجش‌های ROS همانطور که قبلاً توضیح داده شد، انجام شد. به طور خلاصه، برای هر لاین، شش بذر در 3 گلدان مختلف کاشته شد. از نهال‌های حاصل، سه مورد بر اساس یکنواختی انتخاب شدند. نهال‌هایی که غیرمعمول به نظر می‌رسیدند یا به طور قابل توجهی بلندتر یا کوتاه‌تر از اکثریت بودند، استفاده نشدند. چهار دیسک برگی به قطر 3 میلی‌متر از پهن‌ترین قسمت برگ چهارم سه گیاه سورگوم 15 روزه مختلف جدا شدند. یک دیسک برای هر برگ از دو گیاه و دو دیسک از یک گیاه، که دیسک دوم به عنوان کنترل آب در نظر گرفته شد (به پایین مراجعه کنید). دیسک‌ها به صورت جداگانه روی 50 میکرولیتر H2O در یک پلیت 96 چاهکی سیاه شناور شدند، با یک پوشش آلومینیومی بسته شدند تا از قرار گرفتن در معرض نور جلوگیری شود و یک شب در دمای اتاق نگهداری شدند. صبح روز بعد، یک محلول واکنش با استفاده از پروب شیمیایی لومینسانس L-012 با غلظت 2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر (Wako، کاتالوگ شماره 120-04891)، پراکسیداز ترب کوهی با غلظت 2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر (نوع VI-A، سیگما-آلدریچ، کاتالوگ شماره P6782) و 100 میلی‌گرم در میلی‌لیتر کیتین یا 2 میکرومولار Flg22 تهیه شد. 50 میکرولیتر از این محلول واکنش به سه تا از چهار چاهک اضافه شد. چاهک چهارم یک کنترل آزمایشی بود که محلول واکنش به جز MAMP به آن اضافه شد. چهار چاهک خالی که فقط حاوی آب بودند نیز در هر پلیت قرار داده شدند.

پس از افزودن محلول واکنش، میزان لومینسانس با استفاده از دستگاه خوانشگر میکروپلیت چند تشخیص SynergyTM 2 (BioTek) هر 2 دقیقه به مدت 1 ساعت اندازه‌گیری شد. دستگاه خوانشگر پلیت در طول این 1 ساعت، هر 2 دقیقه اندازه‌گیری‌های لومینسانس را انجام می‌دهد. مجموع تمام 31 قرائت برای بدست آوردن مقدار هر چاهک محاسبه شد. مقدار تخمینی برای پاسخ MAMP برای هر ژنوتیپ به صورت (میانگین مقدار لومینسانس سه چاهک آزمایشی - مقدار چاهک آزمایشی) منهای میانگین مقدار چاهک خالی محاسبه شد. مقادیر چاهک خالی به طور مداوم نزدیک به صفر بودند.

دیسک‌های برگینیکوتیانا بنتامیانا، یک لاین سورگوم با پاسخ‌دهی بالا (SC0003) و یک لاین سورگوم با پاسخ‌دهی پایین (PI 6069) نیز به عنوان گروه کنترل در هر پلیت 96 چاهکی برای اهداف کنترل کیفیت در نظر گرفته شدند.

ب. کوکیآماده سازی و تلقیح مایه تلقیح

ب. کوکیمایه تلقیح همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تهیه شد. به طور خلاصه، دانه‌های سورگوم به مدت سه روز در آب خیسانده شدند، آبکشی شدند، در ارلن‌های مخروطی ۱ لیتری ریخته شدند و به مدت یک ساعت در فشار ۱۵psi و دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد اتوکلاو شدند. سپس دانه‌ها با حدود ۵ میلی‌لیتر میسلیوم خیسانده شده از کشت تازه تلقیح شدند.ب. کوکیLSLP18 جدا شد و به مدت 2 هفته در دمای اتاق قرار داده شد و هر 3 روز یکبار فلاسک‌ها تکان داده می‌شدند. پس از 2 هفته، دانه‌های سورگوم آلوده به قارچ در هوا خشک شده و سپس تا زمان تلقیح مزرعه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. از همان مایه تلقیح برای کل آزمایش استفاده شد و هر سال تازه تهیه می‌شد. برای تلقیح، 6 تا 10 دانه آلوده در حلقه گیاهان سورگوم 4 تا 5 هفته‌ای قرار داده شدند. هاگ‌های تولید شده از این قارچ‌ها ظرف یک هفته آلودگی را در گیاهان جوان سورگوم آغاز کردند.

آماده سازی بذر

قبل از کاشت در مزرعه، بذر سورگوم با مخلوطی از قارچ‌کش، حشره‌کش و سیفنر حاوی حدود ۱٪ قارچ‌کش Spirato 480 FS، ۴٪ قارچ‌کش Sebring 480 FS و ۳٪ سیفنر بذر Sorpro 940 ES تیمار شد. سپس بذرها به مدت ۳ روز در هوا خشک شدند که پوشش نازکی از این مخلوط در اطراف بذرها ایجاد کرد. سیفنر امکان استفاده از علف‌کش Dual Magnum را به عنوان تیمار قبل از رویش فراهم کرد.

ارزیابی مقاومت به لکه برگی هدف

SCP در ایستگاه تحقیقات محصولات کشاورزی مرکزی در کلیتون، کارولینای شمالی، در تاریخ‌های ۱۴-۱۵ ژوئن ۲۰۱۷ و ۲۰ ژوئن ۲۰۱۸ در قالب طرح بلوک‌های کامل تصادفی با دو تکرار آزمایشی در هر مورد کاشته شد. آزمایش‌ها در ردیف‌های تکی ۱.۸ متری با عرض ردیف ۰.۹ متر با استفاده از ۱۰ بذر در هر کرت کاشته شدند. دو ردیف مرزی در اطراف حاشیه هر آزمایش کاشته شد تا از اثرات لبه جلوگیری شود. آزمایش‌ها در ۲۰ ژوئیه ۲۰۱۷ و ۲۰ ژوئیه ۲۰۱۸ که در آن گیاهان سورگوم در مرحله رشد ۳ بودند، تلقیح شدند. رتبه‌بندی‌ها در مقیاس یک تا نه انجام شد، که در آن گیاهانی که هیچ نشانه‌ای از بیماری نداشتند، به عنوان عدد نه و گیاهان کاملاً مرده به عنوان عدد یک امتیازدهی شدند. دو رتبه‌بندی در سال ۲۰۱۷ و چهار قرائت در سال ۲۰۱۸، دو هفته پس از تلقیح هر سال انجام شد. sAUDPC (سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری استاندارد شده) همانطور که قبلاً توضیح داده شد، محاسبه شد.