تجزیه و تحلیل ارتباط ژنومی قدرت پاسخ دفاعی ناشی از MAMP و مقاومت به لکه برگ هدف در سورگوم

گیاهان و مواد بیماریزا

یک جمعیت نقشه برداری انجمن سورگوم معروف به جمعیت تبدیل سورگوم (SCP) توسط دکتر پت براون در دانشگاه ایلینویز (اکنون در UC Davis) ارائه شد.قبلاً توضیح داده شد و مجموعه‌ای از خطوط متنوع است که برای تسهیل رشد و نمو گیاهان در محیط‌های ایالات متحده به دوره نوری بی‌حساس و قد کوچک‌تر تبدیل شده‌اند.در این تحقیق 510 لاین از این جمعیت مورد استفاده قرار گرفت، اما به دلیل جوانه زنی بد و سایر مسائل کنترل کیفی، همه لاین ها در تجزیه و تحلیل هر سه صفت مورد استفاده قرار نگرفتند.در نهایت داده های 345 خط برای تجزیه و تحلیل پاسخ کیتین، 472 خط برای پاسخ flg22، و 456 خط برای مقاومت TLS استفاده شد.بی کوکیسویه LSLP18 از دکتر برت بلوم در دانشگاه آرکانزاس به دست آمد.

اندازه گیری پاسخ MAMP

دو MAMP مختلف در این مطالعه flg22، (کاتالوگ Genscript# RP19986) و کیتین استفاده شد.گیاهان سورگوم در درج‌هایی که روی زمین‌های پر از خاک (33 درصد Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) در گلخانه گذاشته شده بود، رشد کردند.گیاهان یک روز قبل از جمع آوری نمونه آبیاری شدند تا از رطوبت اضافی برگ در روز جمع آوری جلوگیری شود.

لاین ها به صورت تصادفی و به دلایل لجستیکی در دسته های 60 لاینی کاشته شدند.برای هر لاین، سه "گلدان" با دو دانه در هر خط کاشته شد.دسته های بعدی به محض اینکه دسته قبلی پردازش شد تا زمانی که کل جمعیت ارزیابی شد، کاشته شدند.دو اجرای آزمایشی برای هر دو MAMP با ژنوتیپ‌های تصادفی‌سازی مجدد در هر یک از دو اجرا انجام شد.

سنجش ROS همانطور که قبلا توضیح داده شد انجام شد.بطور خلاصه به ازای هر لاین شش بذر در 3 گلدان مختلف کاشته شد.از بین نهال های به دست آمده، سه نهال بر اساس یکنواختی انتخاب شدند.نهال هایی که غیرعادی به نظر می رسیدند یا به طور قابل توجهی بلندتر یا کوتاه تر از اکثریت بودند، استفاده نشدند.چهار دیسک برگ به قطر 3 میلی متر از پهن ترین قسمت چهارمین برگ از سه گیاه مختلف سورگوم 15 روزه جدا شد.یک دیسک در هر برگ از دو گیاه و دو دیسک از یک گیاه، که دیسک دوم به کنترل آب تبدیل می شود (به زیر مراجعه کنید).دیسک ها به صورت جداگانه روی 50 میکرولیتر H20 در یک صفحه سیاه 96 چاهی شناور شدند، برای جلوگیری از قرار گرفتن در معرض نور با یک مهر و موم آلومینیومی مهر و موم شدند و یک شب در دمای اتاق نگهداری شدند.صبح روز بعد یک محلول واکنش با استفاده از کاوشگر نورتابی شیمیایی 2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر L-012 (واکو، کاتالوگ شماره 120-04891)، 2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر ترب‌اکسیداز پراکسیداز (نوع VI-A، Sigma-Aldrich، کاتالوگ شماره P6782)، و 100 میلی گرم در میلی لیتر کیتین یا 2 میکرومولار Flg22.50 میکرولیتر از این محلول واکنش به سه چاه از چهار چاهک اضافه شد.چاه چهارم یک کنترل ساختگی بود که محلول واکنش به استثنای MAMP به آن اضافه شد.چهار چاه خالی که فقط حاوی آب بود نیز در هر صفحه گنجانده شد.

پس از افزودن محلول واکنش، لومینسانس با استفاده از دستگاه میکروپلیت خوان چندگانه SynergyTM 2 (BioTek) هر 2 دقیقه به مدت 1 ساعت اندازه گیری شد.صفحه خوان هر 2 دقیقه در طول این 1 ساعت میزان لومینسانس را اندازه گیری می کند.مجموع تمام 31 قرائت برای به دست آوردن ارزش برای هر چاه محاسبه شد.مقدار برآورد شده برای پاسخ MAMP برای هر ژنوتیپ به صورت (متوسط ​​مقدار لومینسانس سه چاه آزمایشی - مقدار چاه ساختگی) - منهای میانگین مقدار چاه خالی محاسبه شد.مقادیر چاه خالی به طور مداوم نزدیک به صفر بود.

دیسک های برگ ازنیکوتیانا بنتامیانایک خط سورگوم با واکنش بالا (SC0003) و یک خط سورگوم با پاسخ کم (PI 6069) نیز به عنوان کنترل در هر صفحه 96 چاهی برای اهداف کنترل کیفیت گنجانده شد.

بی کوکیتهیه تلقیح و تلقیح

بی کوکیتلقیح همانطور که قبلا توضیح داده شد تهیه شد.به طور خلاصه، دانه های سورگوم به مدت سه روز در آب خیسانده شدند، شسته شدند، در فلاسک های مخروطی 1 لیتری ریخته شدند و به مدت یک ساعت در دمای 15psi و 121 درجه سانتی گراد اتوکلاو شدند.سپس دانه ها با حدود 5 میلی لیتر میسلیوم خیسانده از کشت تازه تلقیح شدندبی کوکیLSLP18 جدا شده و به مدت 2 هفته در دمای اتاق باقی می ماند و هر 3 روز یکبار فلاسک ها را تکان می دهیم.پس از 2 هفته، دانه های سورگوم آلوده به قارچ در هوا خشک شدند و سپس در دمای 4 درجه سانتی گراد تا زمان تلقیح مزرعه نگهداری شدند.از همان تلقیح برای کل آزمایش استفاده شد و هر سال تازه ساخته شد.برای تلقیح، 6 تا 10 دانه آلوده در حلقه گیاهان 4 تا 5 هفته ای سورگوم قرار داده شد.اسپورهای تولید شده از این قارچ ها در طی یک هفته باعث عفونت در گیاهان جوان سورگوم شد.

آماده سازی بذر

قبل از کاشت در مزرعه، بذر سورگوم با قارچ کش، حشره کش و مخلوط ایمن کننده حاوی 1% قارچ کش Spirato 480 FS، 4% قارچ کش Sebring 480 FS، 3% محافظ بذر Sorpro 940 ES تیمار شد.سپس دانه ها به مدت 3 روز در هوا خشک شدند که پوشش نازکی از این مخلوط در اطراف دانه ها ایجاد کرد.ایمن کننده اجازه استفاده از علف کش Dual Magnum را به عنوان یک درمان پیش رویشی داد.

ارزیابی مقاومت لکه برگ هدف

SCP در ایستگاه تحقیقاتی محصولات مرکزی در کلیتون، NC در تاریخ 14-15 ژوئن 2017 و 20 ژوئن 2018 در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی با دو تکرار آزمایشی در هر مورد کاشته شد.آزمایش‌ها در ردیف‌های 1.8 متری با عرض ردیف 0.9 متر با استفاده از 10 بذر در هر کرت کاشته شدند.دو ردیف مرزی در اطراف هر آزمایش برای جلوگیری از اثرات لبه کاشته شد.آزمایش‌ها در 20 ژوئیه 2017 و 20 جولای 2018 تلقیح شدند که در آن زمان گیاهان سورگوم در مرحله رشد 3 بودند. رتبه‌بندی‌ها در مقیاس یک تا نه گرفته شد، جایی که گیاهانی که هیچ نشانه‌ای از بیماری را نشان نمی‌دادند به‌عنوان نه و کاملاً نمره‌گذاری شدند. گیاهان مرده به عنوان یک امتیازدهی شدند.دو رتبه‌بندی در سال ۲۰۱۷ و چهار رتبه‌بندی در سال ۲۰۱۸ که هر سال دو هفته پس از تلقیح شروع می‌شد، انجام شد.sAUDPC (منطقه استاندارد شده زیر منحنی پیشرفت بیماری) همانطور که قبلاً توضیح داده شد محاسبه شد.